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1 NGS をはじめよう! Nextera Rapid Capture エクソームキットを用いたエクソームシーケンス - ウェット編 - April 24, 2015 米田瑞穂イルミナ株式会社テクニカルサポート部テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2014 Illumina, Inc. All rights reserved.illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate,HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, ForenSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeqFGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq,TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/orother countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

2 本日の Outline Nextera Rapid Capture エクソームキットの特徴 ライブラリーの調製方法 2

3 Nextera Rapid Capture エクソームキットの特徴 プローブセットは 214,405 ものエクソンを濃縮するよう設計 専門家が選択した 37Mb のエクソン領域をターゲット 様々なサンプルサイズの実験に対応したキット (1,3,6,9,12) サンプル調製からシーケンス データ解析までイルミナがトータルサポート 2015 年 5 月 15 日 NGS をはじめよう! Nextera Rapid Capture エクソームキットを用いたエクソームシーケンス - ドライ編 - 3

4 1 ランに実施可能なサンプル数は? 必要なカバレッジは? NGS をはじめよう! NextSeq で何ができるのか? 2015/04/10 イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト崎川真里 リンク : 4

5 サンプル調製から解析までのワークフロー < 二次解析 > NGS をはじめよう! Nexera Rapid Capture エクソームキットを用いたエクソームシーケンス ドライ編 2015/05/15 イルミナ株式会社バイオインフォマティクスサポートサイエンティスト癸生川絵里 5

6 ライブラリー調製のワークフロー ステップ 1: Nextera ライブラリーステップ 1 ステップで断片化およびアダブターとインデックスの付加を実施 通常のトランスポゾン Nextera 改変型トランスポゾン ゲノム DNA 50 ng のゲノム DNA スタート 300 塩基 タグメンテーション ( トランスポゾンによる断片化 ) 酵素による断片化で Covaris 等の断片化装置不要 P5 配列 インデックス配列 1 PCR 増幅 インデックス配列 2 P7 配列 アダプターとインデックスの付加 NGS で解析可能な DNA 断片 ( ライブラリー ) 6 参考文献 Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome Biology 2010 Dec 8;11(12):R119.

7 ライブラリー調製のワークフロー ステップ 2: ターゲット DNA の濃縮ステップビオチン化プローブはターゲット領域のハイブリダイズした後 ストレプトアビジンビーズでキャプチャーを行う 7

8 8 ワークフロー概要

9 消耗品 装置 ユーザーガイド Consumables and Equipment をご確認ください 9

10 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ インプット DNA は 50 ng を厳守 二本鎖 DNA (dsdna) に固有の蛍光定量ベースの方法を使用して O.D. 260/280 = 程度の純度の DNA を推奨 Copyright 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. Used under permission. Qubit 2.0 Fluorometer siderations-for-dna-isolation-when-using-nexter - インプット DNA を Tris-HCl 10 mm ph 8.5 で 10 ng/μl に正規化 - 10 ng/μl の正規化されたサンプルを 同じ蛍光定量法を使用して再定量 - gdna サンプルを Tris-HCl 10 mm ph 8.5 でさらに希釈して 最終的な量を 5 ng/μl で 10 μl ( 合計 50 ng) に調製 10

11 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 10 ul の 5ng/ul の DNA (50 ng) を 96 ウェル MIDI プレートに分注し タグメンテーション反応用の試薬を各ウェルに加える ( 全量 50 ul) 試薬 5ng/ul input DNA Tagment DNA Buffer Tagment DNA Enzyme 1 容量 10 ul 25 ul 15 ul MIDI プレートを Microseal 'B' でシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 プレートシェーカー 11

12 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション MIDI プレートを 280 g で 1 分間遠心ののち 58 の Microheating System で 10 分間インキュベート 15 ul の Stop Tagment Buffer (ST) をプレートの各ウェルに分注する MIDI プレートを Microseal 'B' でシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 MIDI プレートを 280 g で 1 分間遠心ののち室温で 4 分間インキュベート <Best Practice> - Stop Tagment Buffer は沈殿を生じやすいので 使用前に完全に溶解していることを確認 - Microseal B はバイオラッド社の型番 MSB1001 をご使用いただくことを推奨 - 58 のインキュベートのステップは Microheating System (SciGene) の使用を推奨 12

13 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 あらかじめよく撹拌した 65 ul の Sample Purification Beads (SPB) をプレートの各ウェルに分注 MIDI プレートを Microseal 'B' でシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 MIDI プレートを室温で 8 分間インキュベート MIDI プレートを 280 g で 1 分間遠心ののち シールを取り除く 磁気スタンド上にプレートを 2 分間 ( または 溶液が濁っている場合は透明になるまで ) 置く 磁気スタンド上でビーズを集め 上清 130 ul を捨てる 200 ul の 80% エターノルで洗浄する作業を 2 回繰り返す 13

14 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 MIDI プレートの各ウェルから残っている 80% EtOH を取り除く MIDI プレートを磁気スタンド上に置いたまま室温で 10 分間風乾し エタノールをとばす 22.5 ul の Resuspension Buffer (RSB) で懸濁 MIDI プレートを Microseal 'B' でシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 MIDI プレートを室温で 2 分間インキュベートのち 280 g で 1 分間遠心する 磁気スタンドで 2 分間静置し 上清を 20 ul 回収し 新しい 96 ウェル PCR プレートに回収する <Best Practice> - Sample Purification Beads は使用前に冷蔵庫から出し 室温に戻しておく - 80% エタノールは要時調製のものを用いる 14

15 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 プレートに残っているタグメンテーション反応溶液 1 μl を Agilent High sensitivity DNA Chip を使用する Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer にロードします 広範な分布が約 150 bp ~ 1 kb のサイズ範囲の DNA 断片があるか サンプルのサイズをチェックします 15

16 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 1 st PCR 使用するサンプルの数に合わせて 使用するインデックスの組み合わせを決めておく 使用する Index1 Index2 それぞれのインデックスプライマーを TruSeq Index Plate Fixture に配置する A) Index 1 Primer tubes (orange caps) B) Index 2 Primer tubes (white caps) C) NLA plate 16

17 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 1 st PCR 20 ul のサンプル DNA に PCR の試薬を加えていく ( 全量 50 ul) Tagmented DNA Index1 Primer Index2 Primer 試薬 Nextera Library Amplification Mix 20 ul 5 ul 5 ul 20 ul 容量 耐熱シールでプレートをシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 プレートを 280 g で 1 分間遠心の後 PCR 装置にプレートをセットし 下記のプログラムを実行する a) ヒートリッドオプションを100 Cに設定 b) 72 C for 3 分間 c) 98 C for 30 秒間 d) 10 cycles of: <Best Practice> 98 C for 10 秒間 - インデックスプライマーのキャップは コンタミを防ぐため 60 C for 30 秒間使い捨てになっている 使用後は新しいキャップでふたをする 72 C for 30 秒間 e) 72 C for 5 分間 f) Hold at 10 C Safe stopping point (2~8 Cで2 日間まで保存可 ) 17

18 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 1 st PCR 精製 PCR プレートを PCR 装置より取出し 280 xg で 1 分間遠心 50 ul のサンプル溶液をプレートより取出し 新しい 96 well MIDI プレートに移す よく懸濁した Sample Purification Beads (SPB) を 90 ul を用いて DNA の精製を実施する ( 実施手順は タグメンテーション後の精製ステップと参考にする ) 27 ul の Resuspension Buffer (RSB) で溶出し 上清を 25 ul 回収し 新しい 96 ウェル PCR プレートに回収する <Best Practice> - 上清 25 ul のサンプル溶液を新しプレートに移す際には 20 μl のシングルチャネルピペットまたはマルチチャネルピペットを使用し 12.5 μl にセットして 12.5 μl を 2 回続けて移す 18

19 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 1 st PCR 精製 回収したサンプルの DNA 濃度を 二本鎖特異的な検出が可能な蛍光定量法で測定する Safe stopping point (-15~-25 で 14 日間まで保存可 ) Qubit 2.0 Fluorometer Copyright 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. Used under permission. <Best Practice> - サンプルの正確な濃度定量が 次の濃縮ステップの成功のキーポイント 19

20 ステップ 1 Nextera ライブラリーステップ タグメンテーション 精製 1 st PCR 精製 Agilent DNA 1000 Chip を使用する Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer に 1 μl のライブラリをロードします 約 150 bp 1 kb のサイズ範囲の DNA 断片があるか確認 20

21 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 1 st ハイブリダイゼーション 各サンプル 500 ng ずつを PCR プレートにプーリングしていく 21

22 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 1 st ハイブリダイゼーション Resuspension Buffer (RSB) を全量が 40 ul になるように加える ( 全量が 40 ul を超えた場合は 遠心式濃縮機や限外濾過法を用いて濃縮する ) 試薬 DNA library sample or library pool from plate PrimerEnrichment Hybridization Buffer Coding Exome Oligos Total Volume per Sample 40 ul 50 ul 10 ul 100 ul 容量 PCR プレートを Microseal 'B' でシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 PCR プレートを PCR 装置にセットし 下記のプログラムを実行 a) ヒートリッドオプションを 100 に設定 b) 分間 c) 94 から始まり サイクルごとに 2 下がる 1 分間のインキュベーションを 18 サイクル d) 58 で 90 分以上 最長で 24 時間インキュベート <Best Practice> - 次のステップ (First Capture) に進む準備ができるまでは プレートは 58 に置いたままにする 室温には放置しないこと 22

23 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 1 st ハイブリダイゼーション 1 st キャプチャー PCR プレートをPCR 装置より回収ののち 280 gで1 分間遠心するサンプル溶液全量をMIDIプレートに移すよく懸濁したStreptavidin Magnetic Beadsを各ウェルに250 ulずつ加える MIDIプレートをMicroseal 'B' でシールし プレートシェーカーで5 分間撹拌 MIDIプレートを25 分間室温で静置する 280 gで1 分間遠心するシールを剥がした後 MIDIプレートを磁気スタンドに置き 2 分間 室温で静置する Beadsを吸い込まないように注意しながら ピペットで上清を取り除く磁気スタンドからプレートを外す 23

24 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 1 st ハイブリダイゼーション 1 st キャプチャー あらかじめ溶解 混和した Enrichment Wash Solution を 200 ul ずつ各ウェルに加える Microseal B でシールでする マイクロプレートシェーカーで 4 分間撹拌 各ウェルの全量を上下にそっとピペッティングして サンプルを完全に再懸濁する MIDI プレートを Microseal B でシールする あらかじめ 50 にしておいた Microheating System で 分間インキュベートする ただちに MIDI プレートを磁気スタンドに移し 2 分間静置 ただちに上清を取り除く Enrichment Wash Solution を 200 ul ずつ加え 上記の wash の操作を繰り返す 24

25 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 1 st ハイブリダイゼーション 1 st キャプチャー 1.7 ml マイクロチューブに溶出用の試薬のプレミックスを下記のように用意し 23 ul ずつを MIDI プレートの各ウェルに分注する 試薬 Enrichment Elution Buffer 1 2N NaOH Total Volume per Sample 容量 28.5 ul 1.5 ul 30 ul MIDI プレートを Microseal 'B' でシールし プレートシェーカーで 2 分間撹拌 MIDI プレートを室温で 2 分間静置の後 280 g で 1 分間遠心する MIDI プレートを磁気スタンドで 2 分間静置の後 21 ul の上清を回収し 新しい PCR プレートに移す 4 ul の Elute Target Buffer を各ウェルに加えて 中和する PCR プレートを Microseal 'B' でシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 PCR プレートを室温で 2 分間静置の後 280 g で 1 分間遠心する Safe stopping point (-15 ~-25 で 7 日間まで保存可 ) 25

26 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 1 st ハイブリダイゼーション 1 st キャプチャー 2 nd ハイブリ & キャプチャー 1 st ハイブリダイゼーションと 1 st キャプチャーのステップを繰り返し実施 ただし ハイブリダイゼーションステップのインキュベーション時間が異なる a) ヒートリッドオプションを 100 C に設定 b) 95 for 10 分間 c) 94 から始まり サイクルごとに 2 下がる 1 分間のインキュベーションを 18 サイクル d) 58 で 14.5 時間以上 最長で 24 時間インキュベート 26

27 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 1 st ハイブリダイゼーション 1 st キャプチャー 2 nd ハイブリ & キャプチャー 精製 よく懸濁した Sample Purification Beads (SPB) を 45 ul を用いて DNA の精製を実施する ( 実施手順は 1 st PCR の精製ステップと同様 ) 27.5 ul の Resuspension Buffer (RSB) で溶出し 上清を 25 ul 回収し 新しい 96 ウェル PCR プレートに回収する Safe stopping point (-15~-25 で 7 日間まで保存可 ) 27

28 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 2 nd ハイブリ & キャプチャー 精製 2 nd PCR PCR 用試薬サンプル DNA の入った PCR プレートの各ウェルに加える ( 全量 50 ul) 試薬 Captured DNA PCR Primer Cocktail Nextera Enrichment Amplification Mix 容量 25 ul 5 ul 20 ul PCR プレートを Microseal B でシールし プレートシェーカーで 1 分間撹拌 280 g で 1 分間遠心する PCR 装置に PCR プレートを設置し プログラムを実行 a) ヒートリッドオプションを 100 C に設定 b) 72 for 3 分間 c) 98 for 30 秒間 d) 10 or 12 cycles of: 98 for 10 秒間 60 for 30 秒間 72 for 30 秒間 e) 72 for 5 分間 f) Hold at 10 <Best Practice> - 大きなキャプチャターゲットサイズ ( たとえば > 2 Mb) の場合 10 サイクルの PCR を推奨 - 小さなキャプチャターゲットサイズ ( たとえば < 2 Mb) の場合 クラスター形成およびシーケンスのために適切な収量を得られるようにするため 12 サイクルの PCR を推奨 - Nextera Enrichment Amplification Mix と PCR Primer Cocktail は凍結融解を繰り返さないために 小分けにして冷凍保存することを推奨 28

29 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 2 nd ハイブリ & キャプチャー 精製 2 nd PCR サンプル全量 (50 ul) を MIDI プレートに移す よく懸濁した Sample Purification Beads (SPB) を 90 ul を用いて DNA の精製を実施する ( 実施手順は PCR の精製と同様 ) 32 ul の Resuspension Buffer (RSB) で溶出し 上清を 30 ul 回収し 新しい 96 ウェル PCR プレートに回収する Safe stopping point (-15~-25 で 7 日間まで保存可 ) 29

30 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 2 nd ハイブリ & キャプチャー 精製 2 nd PCR 回収したサンプルの DNA 濃度を 二本鎖特異的な検出が可能な蛍光定量法で測定する 400 bp と仮定 または濃縮ライブラリーの平均サイズに基づいて濃度を計算する 例 ) 15 ng/ul 10^6 = 57 nm (660g/mol 400 bp) Qubit 2.0 Fluorometer qpcr での測定も可能 Sequencing Library qpcr Quantification Guide Copyright 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. Used under permission. KAPA NGS ライブラリ調製キット (Nihon Genetics) 30

31 ステップ 2 ターゲット DNA の濃縮 2 nd ハイブリ & キャプチャー 精製 2 nd PCR Agilent High Sensitivity DNA 1000 Chip を使用する Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer に 1 μl のライブラリをロードします インデックスのレベルによっては サンプルを最初に希釈することが必要になる可能性があります 分布が約 200 bp ~ 1 kb のサイズ範囲があるか DNA 断片ライブラリーのサイズをチェックします 31

32 ステップ 3 NextSeq ランのセットアップ Denature DNA Sample Loading 0.2N NaOH を混和 200 mm Tris-HCl, ph 7 氷冷した HT1 を混合 <Denaturing and Diluting Libraries for the NextSeq 500> < イルミナサポートウェビナー > /04/10 NGS をはじめよう! NextSeq で何ができるのか? NextSeq 試薬カートリッジを冷凍庫から取り出して 溶解 ( 水浴での溶解も可 ) 希釈 変性済みの DNA ライブラリーをロード ラン開始 <NextSeq 500 Kit v1/v2 Reference Guide> <NextSeq 500 System Guide> 32

33 ご清聴ありがとうございました 本日セッション終了後のご質問は にお問い合わせください 33