Microsoft PowerPoint - LongRangePCR+Nextera webinar (with cover)　RevC (本番)

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1 狙った領域を高カバレッジにカバーする Long Range PCR + Nextera 法のご紹介 : ヒトミトコンドリアゲノム解析を例に Oct 3, 2014 ( 注意 ) 一部動画ファイル ( に修正を入れさせていただきアップロードいたします 小林孝史イルミナ株式会社テクニカルサポート部テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2014 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, ForenSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeqFGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/or other countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners. 5

2 ターゲットシーケンスとは? 全ゲノムシーケンス 特長 ゲノム全領域をシーケンス ゲノム全体にわたる変異解析 考慮すべき点 サンプルスループット カバレッジは通常 30x 程度 シーケンス費用がかかる 例 ヒト全ゲノムシーケンス 微生物 de novo シーケンス 動植物リシーケンスなど ターゲットシーケンス 特長 領域を絞ってシーケンス 高いカバレッジの解析が可能 ( 低頻度変異の検出など ) 考慮すべき点 領域外の変異情報のアクセス ゲノム網羅的解析 ( コピー数 ) が難しい カバレッジにむらがある 前処理 ( ライブラリー調製 ) に工夫が必要 例 エクソームシーケンス 疾患別パネル 16S 菌叢解析など 6

3 目的とするターゲット領域ごとに適した手法を選択 ターゲット領域の目安 ~3Kb ~15Kb 100Kb~500kb 700Kb~15Mb 37~62Mb 全エクソーム 3Gb 全ゲノム 手法 アンプリコン (PCR) ベース キャプチャー ( 濃縮 ) ベース キット Tailed PCR Long PCR & Nextera TruSeq Custom Amplicon TruSight Nextera Rapid Capture Custom Nextera Rapid Capture Exome お客様が設計 準備する必要あり イルミナでキットをご提供 7

4 TruSeq Amplicon よりも小さいターゲット領域の解析 お客様がご自由にプライマーを設計いただきライブラリーを調製する方法です Tailed PCR 法 以前のサポートウェビナーにてご案内済みです ~550bp 程度の断片に Tailed PCR を使用してイルミナ NGS で解析するためのアダプターを付加します Long Range PCR+Nextera 法 今回のウェビナーでご紹介します 長鎖の断片を Long Range PCR で増幅し Nextera Kit を使用してインデックスとアダプターを付加する方法です ( 注意 ) これら二つの手法はカスタムプライマーを使用するなどお客様のデザインが影響を与えますので フィールドアプリケーション担当 テクニカルサポート部ではサポートが限られる旨ご了承いただけたらと思います 8

5 [ 以前のウェビナー ] Tailed PCR ( 3Kb までの領域を対象 ) Tailed PCR とは? PCR 増幅する際に イルミナ次世代シーケンサーに対応したアダプターを入れる PCR 増幅のおすすめサイズ : bp 程度 最大 700bpぐらいまで イルミナ次世代シーケンサーに対応したアダプターをいれるには Nexteraアダプター : 2ステップで PCR 増幅およびアダプター付加を実施 TruSeqアダプター : 1 or 2ステップで PCR 増幅およびアダプター付加を実施 カスタムアダプター : 論文などを参照して利用 どのアダプターがよいのか? 以前のウェビナーにて詳細をご案内しています サポート用ウェビナー ( 9

6 Long Range PCR + Nextera (3Kb の領域を対象 ) Long Range PCR + Nextera とは? 比較的大きな領域に対して ロングレンジのPCRを実施 その後 イルミナのNexteraシリーズのライブラリー調製キットを使う Nextera DNA Sample Prep Kit + Nextera Index Kit Nextera XT Sample Prep Kit + Nextera XT Index Kit Tailed PCR より 広めの範囲をカバーできる ポイント ターゲットとする領域と その周辺 200~300bp 領域を対象に増幅することをおすすめ 10

7 Long Range PCR & Nextera のながれ プライマーの設計および注文 ターゲット領域ぎりぎりでなく 両端 100~150bp 程度余裕を持たせて設計 Long Range PCR TaKaRa PrimeSTAR GXL DNA Polymerase ( などの Long Range PCR 用酵素 ) を用いて PCR 所要時間 : PCR の長さによって異なります Nextera ライブラリー調製 Nextera XT DNA Sample Prep Kit ( ビーズ精製で簡単に濃度をそろえたい ) Nextera DNA Sample Prep Kit ( カバレッジをより平均的に得たい ) 所要時間 : 半日程度 MiSeq シーケンス (PCR Amplicon) MiSeq Reporter 内の PCR Amplicon ワークフローで解析 ( 全ゲノムの内 ターゲット領域を指定するマニフェストファイルを作成 ) 所要時間 : 5 時間 (1x50bp) ~ 56 時間 (2x300 bp) 11

8 Long Range PCR には TaKaRa PrimeSTAR GXL が最適との報告 Scientific Rep.4: (Jul 2014) Long Range PCR 用の 6 種類の PCR 酵素を比較 Invitrogen SequalPrep Invitrogen AccuPrime TaKaRa PrimeSTAR GXL TaKaRa LA Taq Hot Start KAPA Long Range Hot Start QIAGEN Long Range PCR polymerase 対象は BRCA1/2 遺伝子全長 TaKaRa PrimeSTAR GXL DNA Polymerase が増幅効率が良いと報告 幅広い Tm 断片長 (5.8kb-12.9kb) 30 サイクル 弊社が実験データを保証するものではございません 参考資料としてご使用ください 12

9 Nextera の原理 通常のトランスポゾン Nextera 改変型トランスポゾン PCR 産物 最少わずか 1 ng の二本鎖 DNA スタート 700 塩基程度 タグメンテーション ( トランスポゾンによる断片化 ) 酵素による断片化で断片化装置不要 P5 配列 インデックス配列 1 PCR 増幅 インデックス配列 2 P7 配列 インデックス配列を追加で最大 384 サンプルまで 1 ランでの同時解析が可能 MiSeq で解析可能な DNA 断片 ( ライブラリ ) 参考文献 Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome Biology 2010 Dec 8;11(12):R

10 ポイント : 両端ぎりぎりに Long Range PCR プライマーを設計しないように! トランスポゾンが DNA の両端に対して作用する 両末端のカバレッジが低くなる 参考文献 : Nextera XT sample prep kit product data sheet 14

11 Long Range PCR & Nextera だと データトリミングの影響は受けない MiSeq 300bp x2 で解析した例 300bp のリードをトリミングすると 300bp 300bp 真ん中の領域が読めない! 200bp 200bp ターゲット領域が 550bp の場合 (Tailed PCR) Long Range PCR & Nextera の場合ランダムに重ねてシーケンスできるため読めない領域はない 15

12 注意 : 多様性の低いライブラリー Tailed PCR 由来のサンプル塩基の多様性が低くなりがち : PhiX を加えることで対策 Long Range PCR & Nextera の場合に想定されるグラフリードの最初が多様性が低くなる傾向 ポイント 主にトランスポゾームでの切断時に生じる偏りで データに与える偏りは小さい 通常のクラスター密度であれば大きくデータに影響することはない クラスター密度が非常に高い場合には 通常のサンプルと比べてクオリティ値が下がる場合がある 16

13 MiSeq Reporter での解析例 (HiSeq で解析の場合は他の解析パイプラインが必要です ) サンプルシート作成完了 17

14 Manifest File の作成 (PCR amplicon workflow 使用の際に必要になります ) マニフェストファイルは 参照ゲノムファイルのターゲット領域を設定するもの リファレンスとして参照する配列を 簡単なステップで作成 Step 1 全ヒトゲノムなどのデータベースを選択 * Step 2 ターゲットとする領域を簡単操作に設定 * 別途使用するファイルを作成し 追加して選択することも可能です 18

15 MiSeq 付属ソフト Miseq Reporter でわかりやすい出力ファイルを作成 ズームイン アウト カバレッジとミスマッチ サンプルの表 クオリティ値 SNP/indel アノテーション ターゲットの表 サンプルおよび変異 アライメントは Smith-Waterman 変異コールは GATK が初期設定 体細胞性変異は Starling 19

16 Long Range+Nextera を使用してミトコンドリアを解析する 従来はサンガー法で解析されることが多かった イルミナ NGS にシフト! カバレッジが深くなるためにヘテロプラスミーなども解析可能に 用途ミトコンドリアゲノム解析は法医学的に有用 細胞内コピー数が多い 変異レートが小さい 母型のみのアレルが遺伝される ( たとえば ) ベトナム コソボ地方 ソマリアなどの多数の遺体を収納するお墓から骨としてサンプルを収集 骨からミトコンドリアゲノムを回収し同定する ミトコンドリア全ゲノムを解析するか D-loop 領域を解析する documents/products/appnotes/appnote_vietnam_mtdna.pdf 20

17 ミトコンドリア全ゲノムを解析するか D-Loop 領域のみを解析するか? ミトコンドリア全長 (16kb) を解析するか? D-loop 領域 (1.1kb) のみを解析するか? D-loop 領域 (1.1kb) 遺伝子をコードしない領域で二つの超可変領域 (HVI/HVII) を持ち変異が多様であるため遺伝情報を多く有する 正確性を重視 さらに多サンプル解析が可能 1) mtdna and its role in ancestry. Genebase Tutorials. Retrieved October 1, 2014, from 2) Journal of Human Genetics 56,

18 Long Range PCR+Nextera を用いた mtdna のシーケンス 全 mtdna 全 mtdna DNA 増幅 ライブラリー作製 ライブラリー定量 シーケンスデータ解析 8 時間 1.5 時間 1.5 時間 25 時間 mtdna D-loop DNA 増幅 ライブラリー作製 ライブラリー定量 シーケンスデータ解析 1.5 時間 1.5 時間 1.5 時間 25 時間 Long Range PCR Nextera XT Kit 最多 384 サンプルを MiSeq の 1 ランで解析 (Nextera XT Index Kit V2 を使用 ) 22

19 Long Range PCR & Nextera プロトコール例 -1 ( ヒト全ミトコンドリア DNA 解析 ) ヒトミトコンドリア DNA の全長を解析 (16,569 bp) 2つの Long Range PCR で増幅 9.1kb & 11.2kb Takara LA Taq にて増幅 Long Range PCR 後にイルミナNextera XTにてライブラリーを作成 Nextera XT DNA Sample Prep Kit Nextera XT Index Kit シーケンス MiSeq 150bp x2 MSR (MiSeq Reporter Sotware) mtdnaプラグインにて二次解析 mtdna Variant Analyzer にて出力 mtdna_genome_guide_ html 23

20 Step1) PCR 断片の増幅 ヒトミトコンドリア DNA の全長 (16,569 bp) をオーバーラップ含めて 2 つの断片として Long Range PCR (30 cycle) にて増幅 MTL-F1+ MTL-R1: 9065 bp MTL-F2+ MTL-R2: bp の断片がそれぞれ得られる 24

21 Step1) PCR 断片の増幅 AMPure ビーズで余剰プライマーを除去後 断片長を Bioanalyzer で計測 MTL-F1+ MTL-R1: 9065 bp MTL-F2+ MTL-R2: bp 25

22 Step2) PCR 断片から Nextera XT Kit を使用してライブラリ作製 ワークフローは Nextera XT DNA Sample Prep Kit と同様です インデックスプライマーの添加も TruSeq Index Plate Fixture を使用して簡単に行えます 12 cycle の PCR 反応を実施 TruSeq Index Fixture Plate 26

23 Step3) サンプル数に応じてノーマライゼーション 最終的に得られるライブラリーサイズは 150~1000bp 程度となります サンプル数 ) 少量 : 変性してマニュアル操作でプール a_library_validation.pdf 27 多量 : Nextera XT Sample Prep Kit 同封の Normalization Beads を使用 変性操作が必要ありません

24 Long Range PCR & Nextera プロトコール例 -2 ( ヒトミトコンドリア D-loop 領域解析 ) ミトコンドリアの D-Loop 領域 (1.1kb) をオーバーラップした 350bp 程度の 4 種類のアンプリコンに分けて増幅 Long Range PCR 後にイルミナNextera XTにてライブラリーを作成 Nextera XT DNA Sample Prep Kit Nextera XT Index Kit シーケンス MiSeq 150bp x2 MSR (MiSeq Reporter Sotware) mtdnaプラグインにて二次解析 mtdna Variant Analyzer にて出力 mtdna_d_loop_hypervariable_region_guide_ html 28

25 D-Loop 領域解析のワークフロー ミトコンドリアゲノム領域 (16kb) 中の D-loop 領域のみを 4 種類の PCR 断片 (350bp) を増幅する PCR 断片をまとめて Nextera XT Sample Prep Kit でライブラリーを作製する 最多 96 サンプル ( 現在は 384 サンプル ) をプール MiSeq V2 kit, 2x150 bp で解析 サンプルあたり 1 万 Read 以上で解析 documents/products/appnotes/appnote_vietnam_mtdna.pdf 29

26 Step1) PCR 断片の増幅 オ - バーラップがある 4 種類の断片を Long Range PCR で増幅 (10 cycle + 25 cycle の計 35 cycle の PCR) ( 例 )Forward/Reverse primer- それぞれ 2 種類のプライマーをミックス F29-A: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGTCTATCACCCTATTAACCAC F29-B: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTCTATCACCCTATTAACCAC R285-A: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGGGTTTGGTGGAAATTTTTTG R285-B: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGGTTTGGTGGAAATTTTTTG 緑字 黄字はインデックスプライマーがアニールする配列を示す ( ポイント ) 両端の配列を余さず解析することが可能となる 30

27 Step1) PCR 断片の増幅 AMPure ビーズで余剰プライマーを除去後 断片長を Bioanalyzer で計測 平均断片長 350bp のピーク 正しく増幅された 4 種類の断片 31

28 Step2) PCR 断片から Nextera XT Kit を使用してライブラリ作製 ワークフローは Nextera XT DNA Sample Prep Kit と同様です インデックスプライマーの添加も TruSeq Index Plate Fixture を使用して簡単に行えます 12 cycle の PCR 反応を実施 TruSeq Index Fixture Plate 32

29 Step3) サンプル数に応じてノーマライゼーション 最終的に得られるライブラリーサイズは 150~450bp 程度となります サンプル数 ) 少量 : 変性してマニュアル操作でプール a_library_validation.pdf 33 多量 : Nextera XT Sample Prep Kit 同封の Normalization Beads を使用 変性操作が必要ありません

30 ヒト全ミトコンドリア DNA (mtdna) 解析例 mtdna 全 16kb mtdna ゲノムを均一なカバレッジでシーケンス 34

31 mtdna Variant Analyzer 出力例 設定クオリティ値 (Q 値 ) の閾値を設定可能 詳細ビュー シーケンスデータ色は塩基のクオリティを示す 35

32 まとめ 今回のウェビナーでは Long Range PCR+Nextera のアプリケーションにつきまして下記をご案内いたしました ターゲット領域が TruSeq Custom Amplicon よりも小さく Tailed PCR よりも大きい際に有効です プロジェクトに沿ったプライマーペア Nextera XT DNA Sample Prep Kit, Nextera XT Index Kit (V1 あるいは V2) の準備が必要です 細かいプロトコールは mtdna 解析のプロトコールを参照ください カスタムプライマーを使用するなどお客様のデザインが影響を与えますので フィールドアプリケーション担当 テクニカルサポート部ではサポートが限られる旨ご了承いただけたらと思います 36

33 37 ご清聴頂きありがとうございました しばらくご質問をいただく時間を設けます