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1 イルミナウェビナー NextSeq 500 シリーズ RNA Seq 時代到来 : NextSeq が実現する簡単 高速 安価なトランスクリプトーム解析 2014 年 9 月 16 日イルミナ株式会社シーケンシングスペシャリスト鈴木健介 2013 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, IlluminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, NuPCR, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, TruSight, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 研究トレンドは RNA Seq に移行 100% 90% Award $ - newly-funded grants: GEX 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% RNA-seq Gene Expression Arrays NIH データベースから新規遺伝子発現解析のグラントが RNA-Seq か発現アレイかを集計 2 2

3 急速に広がる RNA Seq 手法 論文数 * 年 * NCBI Pubmed を RNA-Seq で検索した結果を年ごとに集計 3 3

4 本日の内容 今なぜ RNA Seq? マイクロアレイの原理と限界 RNA Seq の原理と長所 何故 RNA-Seq をやるのか NextSeq 500 が実現する簡単 高速 安価な RNA Seq NextSeq 500 紹介 RNA Seqワークフロー RNA Seqコスト 更に詳しく知りたい方へ 4 4

5 マイクロアレイの原理と限界 5 5

6 マイクロアレイの原理と限界 マイクロアレイのプローブ マイクロアレイ 遺伝子の一部分の配列からプローブを設計 サンプルとハイブリダイゼーションさせ発現量を調べる 6 6

7 マイクロアレイの原理と限界 遺伝子の一部 ( プローブ設計部分 ) しか見ていない 7 7

8 マイクロアレイの原理と限界 他の遺伝子や偽遺伝子に同じ配列があると区別できない 8 8

9 RNA Seq の原理と長所 9 9

10 RNA Seq の原理と長所 スプライスアイソフォーム エクソンスキップ Poly-A 付加位置の異なる転写産物 融合遺伝子 10 10

11 臓器特異的なスプライスアイソフォームの発現 様々なバリエーション Wang ET, et al. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature 456: Fig. 2 を改変

12 アルツハイマーにおけるスプライスアイソフォーム 患者由来の脳 RNA Seq : APOE の解析結果 Twine NA, et al., (2011) Whole Transcriptome Sequencing Reveals Gene Expression and Splicing Differences in Brain Regions Affected by Alzheimer s Disease. PLoS ONE 6(1): e Figure 3 の一部を抜粋

13 癌において発現する偽遺伝子 13 種類の癌を対象に 293 サンプルを解析 これまでの課題 : 高い配列の類似性のために偽遺伝子と遺伝子の発現を分けて解析することは困難 本論文 : RNA Seq により 偽遺伝子を区別して発現を解析 癌種特異的に発現している偽遺伝子の発現を観察 偽遺伝子の発現は転写産物全体に重要な影響を与え 細胞間の違いや癌の進行に重要な役割を果たしていると考察 Kalyana-Sundaram S, et al,. Expressed pseudogenes in the transcriptional landscape of human cancers. Cell Jun 22;149(7):

14 癌の融合遺伝子 COSMIC データベースの Curated Fusions で 208 の登録 (2014 年 9 月 10 日時点 )

15 RNA Seq で可能なこと スプライスバリアントごとの発現解析 融合遺伝子の検出 アリルごとの発現解析 新規転写産物の発見 解析 Non coding RNA の解析 超微量からの発現解析 July Vol 5 No 7 Nature Methods 5 (2008) The beginning of the end for microarrays? 幅広いダイナミックレンジ 15 15

16 本日の内容 今なぜ RNA Seq? マイクロアレイの原理と限界 RNA Seq の原理と長所 何故 RNA-Seq をやるのか NextSeq 500 が実現する簡単 高速 安価な RNA Seq NextSeq 500 紹介 RNA Seqワークフロー RNA Seqコスト 更に詳しく知りたい方へ 16 16

17 今後の遺伝子発現解析を大きく変える NextSeq 500 RNA Seq に最適な次世代シーケンサー 17 17

18 プッシュボタンで操作する簡易性 試薬カートリッジ バッファー 廃液 フローセル 18 18

19 サンプルから答えまでのワークフロー NeoPrep NextSeq 500 BaseSpace PC でデータを閲覧 自動化装置近日リリース予定 ライブラリー 調製 シーケンス一次解析二次解析 RNA Seq 時間 ( ハンズオン時間 ) 8 時間 18 時間 ( 手動 5.5 時間 ) ( 自動 30 分 ) ( 10 分 ) 4 時間 / サンプル ( 5 分 )

20 RNA Seq: キットの選択 TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 ストランド情報に興味がある No Yes TruSeq Stranded mrna Sample Prep Kit ncrna にも興味がある No Yes 細胞質だけでなくミトコンドリアの rrna も除去したい No Yes TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold 20 20

21 TruSeq RNA Sample Prep Kit ワークフロー Total RNA から poly A を使い mrna を回収 AAAAA RNA の断片化 AAAAA NNNNNN ランダムプライマーを用いた cdna 合成 NNNNNN 1 日 2 本鎖 cdna 合成 末端修復 リン酸化 A テイル付加 P A P A P P インデックス付アダプターのライゲーション T A A T ビーズによるサイズ選択 T A A T 15 サイクル PCR A T T A 21 21

22 データ解析 : BaseSpace で簡単に! 主要アプリケーションを搭載 全ゲノム解析 エクソーム解析 RNA-Seq 解析 腫瘍 / 正常細胞解析

23 データ解析 : ウェブブラウザをクリックすることで行なう 4つのステップで実施 1. TopHat をラン 2. TopHat の QC を実施 必要に応じてサンプルを排除 3. Cufflinks をラン コントロールグループの選択 比較グループの選択 4. グループ間を視覚化 遺伝子発現の相関性

24 結果はエクセルと IGV で閲覧可能 24 24

25 TopHat Fusion による融合遺伝子候補のレポート RNA Seq による融合遺伝子の検出 RNA Seq リードの中に csnp や InDel を検出 25 25

26 RNA Seq: サンプルあたりのコスト試算ライブラリー調製およびシーケンスラン試薬 アレイより安価に解析ができるようになりました! 解析目的例 必要リード数 NextSeq サンプルあたりのコスト 遺伝子ごとの発現プロファイル解析 ( 発現アレイと同等の解析 ) 1000 万 18,200 転写産物ごとの発現プロファイル解析 (mrna Seq) 2500 万 x2 36,700 ncrna も含んだ発現プロファイル解析 (Total RNA Seq) 5000 万 x2 70,

27 高い互換性を示す RNA Seq 結果 HiSeq vs. NextSeq

28 RNA Seq : イルミナ東京ラボでの NextSeq 解析結果 タカラバイオ社市販 RNA サンプル 3 種 ( ヒト心臓 心臓疾患 肝臓 ) Ambion 社市販 RNA サンプル 1 種 ( ヒト脳 ) BaseSpace プロジェクトとしてデータをシェアしています 28 28

29 本日の内容 今なぜ RNA Seq? マイクロアレイの原理と限界 RNA Seq の原理と長所 何故 RNA-Seq をやるのか NextSeq 500 が実現する簡単 高速 安価な RNA Seq NextSeq 500 紹介 RNA Seqワークフロー RNA Seqコスト 更に詳しく知りたい方へ 29 29

30 イルミナウェビナー

31 参考文献 マイクロアレイとの比較 Liu, S., Lin, L., Jiang, P., Wang, D. & Xing, Y. A comparison of RNA-Seq and high-density exon array for detecting differential gene expression between closely related species. Nucleic Acids Res. 39, (2011). Marioni, J.C., Mason, C.E., Mane, S.M., Stephens, M. & Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, (2008). Mortazavi, A., Williams, B.A., McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods 5, (2008). RNA Seq の再現性 Shi, L. et al. The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter- and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. Nat. Biotechnol. 24, (2006). SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nat. Biotechnol. doi: /nbt.2957 (24 August 2014). 't Hoen, P.A. et al. Reproducibility of high-throughput mrna and small RNA sequencing across laboratories. Nat. Biotechnol. 31, (2013)

32 NextSeq 500 システム : 実機はラボにて見学可能 RNA Seq トレーニングも実施中 32 32

33 ご清聴ありがとうございました 33 33