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みいかあわび
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NGS をはじめよう! NextSeq500 で何ができるのか? April 10, 2015 崎川真里イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2014 Illumina, Inc. All rights reserved.

Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, ForenSeq, MiSeq,

Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of

1 NGS をはじめよう! NextSeq500 で何ができるのか? April 10, 2015 崎川真里イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2014 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, ForenSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeqFGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/or other countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

2 本日の Outline イルミナのシーケンサーとNextSeqの位置づけ NextSeq500でおすすめするアプリケーションのご紹介エクソーム解析 RNA-Seq 全ゲノム解析 NextSeq500を使う 2

3 本日の Outline イルミナのシーケンサーとNextSeqの位置づけ NextSeq500でおすすめするアプリケーションのご紹介エクソーム解析 RNA-Seq 全ゲノム解析 NextSeq500を使う 3

4 次世代シーケンサーの用途 ( 解析データ登録数 ) セルイノベーション公共 SRA データ統計情報より集計日 : 2015/04/08 解析の種類 HiSeq2000 MiSeq エクソーム解析 96, 全ゲノム解析 * 311,586 32,638 RNA-Seq 109,032 2,431 アンプリコン 13,314 37,836 ChIP-Seq 17, Bisulfite-Seq 6, クローン配列確認 1,166 1,947 * 全ゲノム解析は MiSeq では微生物 HiSeq ではヒトなどの高等真核生物を対象とする場合が多い全ゲノム解析エクソーム解析 RNA-Seq が人気 4

5 イルミナ次世代シーケンサーアプリケーションデスクトップ型大型 MiSeq NextSeq 500 HiSeq 2500 HiSeq 4000 HiSeq X Ten データ量 15 Gb 120 Gb 1,000 Gb 1,500 Gb 1,800 Gb 最大リード長 300x2 150x2 250x2 150x2 150x2 Gb あたりのコスト約 1.7 万円約 0.6 万円 HO 約 0.6 万円 RR 約 0.8 万円約 0.4 万円約 0.1 万円アプリケーション遺伝子パネル非対応ターゲット非対応 RNA-Seq 非対応エクソーム非対応全ゲノム非対応 5

6 NextSeq500 全ゲノム解析にも対応のデスクトップ型シーケンサーライブラリー調製シーケンス一次解析二次解析エクソーム解析 RNA-Seq & トランスクリプトーム解析全ゲノム解析 6

7 NextSeq500 のデータ出力量と試薬キットキットリード長データ出力ラン時間クオリティ高出力フローセル (High Output Kit) ~400M シングルリード ~800M ぺアエンドリード中出力フローセル (Mid Output Kit) ~130M シングルリード ~260M ペアエンドリード 2 x 150 bp Gb 29 時間 > 75% >Q30 2 x 75 bp Gb 18 時間 > 80% >Q30 1 x 75 bp Gb 11 時間 > 80% >Q30 2 x 150 bp Gb 26 時間 > 75% >Q30 2 x 75 bp Gb 15 時間 > 80% >Q30 据付時の仕様はイルミナ PhiX コントロールライブラリーを使いサポート範囲内でのクラスター密度 ( k/mm2 パスフィルタークラスター ) を基にしています実際のパフォーマンス項目はサンプルの種類クオリティそしてパスフィルタークラスターに依存します Q30 以上の塩基の割合はそのラン全体の平均値です時間は NextSeq 500 システム上で実施するクラスター形成シーケンスベースコールを含みます ( デュアルサーフェススキャン ) クオリティ値 (Q スコア ) はベースコールにおけるエラー確率の予測指標です Q30 以上の割合はラン全体の平均値を示しますリードごとサイクルごとの値ではありません 7

8 本日の Outline イルミナのシーケンサーとNextSeqの位置づけ NextSeq500でおすすめするアプリケーションのご紹介エクソーム解析 RNA-Seq 全ゲノム解析 NextSeq500を使う 8

9 エクソーム解析とは gdna 断片からエクソン領域だけをキャプチャーし濃縮を行いシーケンス解析を行うシーケンスデータ ( リード ) ターゲット領域遺伝子 ( エクソン領域 ) エクソン領域のみシーケンスを行うことでシーケンスとデータ解析のコストを削減 9

10 エクソーム解析のレビュー Nature Reviews Genetics Exome 解析で原因遺伝子を示した 29 の文献を一覧表にまとめているほとんどの解析が 1 4 家系 1 4 症例で行われている遺伝性疾患の解析に威力を発揮 Bamshad MJ, et al., Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery. Nat Rev Genet Sep 27;12(11):

11 日本におけるエクソーム解析例横浜市立大学松本直通教授がエクソーム解析によって明らかにした遺伝病の原因遺伝子 ( 一部 ) 年月疾患名原因遺伝子掲載雑誌 2013 年 2 月 SENDA( 脳内鉄沈着神経変性症の 1 つ ) WDR45 Nature Genetics 2013 年 2 月ジュベール症候群と関連症候群 CEP290, TMEM67, INPP5E Journal of Human Genetics 2012 年 8 月大田原症候群 KCNQ2 Annals of Neurology 2012 年 3 月コフィン - シリス症候群 SMARCB1 SMARCA4 SMARCE1 ARID1A ARID1B SMARCA2 Nature Genetics 2012 年 2 月重症型もやもや病 RNF213 Neurology 2011 年 10 月 HCAHC( び漫性大脳白質形成不全症 ) POLR3A, POLR3B American Journal of Human Genetics 2011 年 8 月 ARCA( 常染色体劣性遺伝性小脳変性症 ) SYT14 American Journal of Human Genetics 横浜市立大学ホームページより抜粋 11

12 イルミナで提供しているエクソーム濃縮キットのご紹介キットカタログ番号 Nextera Rapid Capture Exome Nextera Rapid Capture Expanded Exome ターゲットサイズ 37Mb 62Mb コンテンツエクソンエクソン UTRs mirna 必要なシーケンス 4Gb 以上 8Gb 以上製品名 FC Nextera Rapid Capture Exome (8 反応 1 プレックス ) FC Nextera Rapid Capture Exome (8 反応 3 プレックス ) FC Nextera Rapid Capture Exome (8 反応 6 プレックス ) FC Nextera Rapid Capture Exome (8 反応 9 プレックス ) FC Nextera Rapid Capture Exome (2 反応 12 プレックス ) FC Nextera Rapid Capture Exome (4 反応 12 プレックス ) FC Nextera Rapid Capture Exome (8 反応 12 プレックス ) 12

13 NextSeq1 ランに何サンプル流せるか? エキソーム解析出典 : NextSeq 500 System Exome Sequencing Solution NextSeq 500 Mid out put フローセル NextSeq 500 High out put フローセルで推奨 3 サンプルで推奨 9 サンプルをインデックスを付けて一度に流すことができます 13

14 エクソーム解析に採用するカバレッジ L x N C= G C = x カバレッジ G = ターゲットサイズ (base) L = リード長 (bp) = サイクル数 N = リード数キットリード長データ出力高出力フローセル ~400M シングルリード ~800M ペアエンドリード中出力フローセル ~130M シングルリード ~260M ペアエンドリード 2 x 150 bp Gb 2 x 75 bp Gb 1 x 75 bp Gb 2 x 150 bp Gb 2 x 75 bp Gb 例 ) Exome ( ターゲットサイズ 37Mb) 3サンプルを等量で混合し NextSeq500の中出力フローセルで 2x150bpのランを行った場合 1サンプルあたりのリード数は 260Mリード / 3 sample = 86.7 Mリード C = 150bp x 86.7 M / 37 Mb = およそ x351のカバレッジ Coverage Calculation Tech Note 14

15 リード数とカバレッジの関係出典 : Read Length and Nextera Rapid Capture Exome Data Coverageを上げるとターゲットにアラインされるリード数が増える NextSeq 500 Mid out putフローセルで推奨 3サンプル NextSeq 500 High out putフローセルで推奨 9サンプル 15

16 リード長は長い方がいい出典 : Read Length and Nextera Rapid Capture Exome Data リード長が長いほど Coverage Uniformity にばらつきが少ない 16

17 エクソーム解析解析のワークフローライブラリー調製シーケンス QC アライメント変異コールアノテーション Nextera Rapid Capture Exome NextSeq (2x 150bp) SAV Enrichment Variant Studio 17

18 本日の Outline イルミナのシーケンサーとNextSeqの位置づけ NextSeq500でおすすめするアプリケーションのご紹介エクソーム解析 RNA-Seq 全ゲノム解析 NextSeq500を使う 18

RNA-Seq で何ができるか? 19 http://www.illuminakk.co.

19 RNA-Seq で何ができるか? 19

20 RNA-Seq 癌において発現する偽遺伝子 13 種類の癌を対象に 293 サンプルを解析これまでの課題 : 高い配列の類似性のために偽遺伝子と遺伝子の発現を分けて解析することは困難本論文 : RNA Seqにより偽遺伝子を区別して発現を解析癌種特異的に発現している偽遺伝子の発現を観察偽遺伝子の発現は転写産物全体に重要な影響を与え細胞間の違いや癌の進行に重要な役割を果たしていると考察 Kalyana-Sundaram S, et al,. Expressed pseudogenes in the transcriptional landscape of human cancers. Cell Jun 22;149(7):

21 NextSeq 1 ランに何サンプル流せるか? RNA-Seq 解析目的例遺伝子発現プロファイル ( 発現アレイと同等の解析 ) スプライスバリアント含む転写産物発現プロファイル (mrna-seq) ncrna を含む転写産物発現プロファイル (Total RNA-Seq) 必要リード数 10M (1x75 bp) 25M (2x75 bp) 50M (2x75bp) NextSeq サンプル数 40 サンプル / ラン 16 サンプル / ラン 8 サンプル / ラン 21

22 本日の Outline イルミナのシーケンサーとNextSeqの位置づけ NextSeq500でおすすめするアプリケーションのご紹介エクソーム解析 RNA-Seq 全ゲノム解析 NextSeq500を使う 22

全ゲノム解析 1 ランで何サンプル流せるのか? Sequencing Coverage Calculator http://support.illumina.

23 全ゲノム解析 1 ランで何サンプル流せるのか? Sequencing Coverage Calculator ゲノムサイズ必要なカバレッジランの条件から 1 フローセルあたりに流せるサンプル数が計算される 23

24 本日の Outline イルミナのシーケンサーとNextSeqの位置づけ NextSeq500でおすすめするアプリケーションのご紹介エクソーム解析 RNA-Seq 全ゲノム解析 NextSeq500を使う 24

25 プッシュボタンで操作する簡易性フローセル試薬カートリッジバッファー廃液 25

26 NextSeq 500 ライブラリーからデータ解析まで試薬セットアップハンズオン時間 15 分間総所要時間 1.5 時間シーケンスハンズオン時間 20 分間総所要時間時間ライブラリーの変性と希釈データ解析 Bcl2fastq で FASTQ ファイル取得追加解析 FASTQ ファイルから各種解析を実 *3rd party 環境試薬カートリッジの準備フローセルの準備試薬カートリッジへのライブラリーの分注 NCS インターフェイスからランのセットアップ 26

27 Library Preparation ( ライブラリーの調製準備 ) ライブラリーの変性と希釈試薬カートリッジの準備調製済みライブラリーを NaOH で変性 HT1 で希釈し最適なクラスター密度になるようにする Flow Cell の準備試薬カートリッジへのライブラリーの分注 NCS インターフェースからランのセットアップ推奨のライブラリー使濃度は1.8 pm qpcrでの定量をお薦め ( オプション ) PhiXコントロールを 2 pmに希釈して希釈済みライブラリーに1% ( 体積で ) スパイクイン 27

28 NextSeq 500 試薬カートリッジの準備ライブラリーの変性と希釈試薬カートリッジの準備 Flow Cell の準備試薬カートリッジを室温の ( 蒸留 or MilliQ ) に 60 ~ 90 分間浸し中を溶かす使前にカートリッジを 5 回転倒撹拌する試薬カートリッジへのライブラリーの分注 NCS インターフェースからランのセットアップ 28

29 Flow Cell の準備ライブラリーの変性と希釈試薬カートリッジの準備使前の Flow Cell をアルミ包装にった状態で室温に 30 分間置き室温に戻す Flow Cell の準備試薬カートリッジへのライブラリーの分注ガラス部分をレンズ紙で拭いて乾かす NCS インターフェースからランのセットアップ 29

30 試薬カートリッジへのライブラリーの分注ライブラリーの変性と希釈試薬カートリッジの準備希釈済みライブラリーを試薬カートリッジの 10 番ポートに分注する Flow Cell の準備試薬カートリッジへのライブラリーの分注 NCS インターフェースからランのセットアップ 30

31 NCS インターフェイスからランのセットアップライブラリーの変性と希釈試薬カートリッジの準備 Flow Cell の準備ディスプレイに表されるガイド画をタッチパネル操作きなボタンで簡単な操作をナビゲート数回タッチするだけでラン実が可能試薬カートリッジへのライブラリーの分注 NCS インターフェースからランのセットアップ 31

32 NCS からのラン開始ライブラリーの変性と希釈プレランチェックで問題が無ければ Start をクリックしてラン開始試薬カートリッジの準備 Flow Cell の準備試薬カートリッジへのライブラリーの分注 NCS インターフェースからランのセットアップ 32

33 イルミナ NGS データ解析ワークフロー画像データ NextSeq ベースコールシグナル強度塩基配列品質値 (bcl 形式 ) デマルチプレックス塩基配列 (FASTQ.gz 形式 ) データ解析結果データ解釈ベースコール形式変換データ解析コピー移動 NCS BaseSpace クラウド BaseSpace オンサイトサードパーティソフトウェア bcl2fastq 33 HiSeq HCS BaseSpace クラウド Illumina Compute サードパーティソフトウェア bcl2fastq MiSeq MCS BaseSpace クラウド MSR サードパーティソフトウェア MSR

34 NextSeq データ解析 3 つのオプション bcl2fastq 2.0 ローカルストレージ NextSeq オプション bcl2fastq 2.0 ローカルストレージ NextSeq オプション bcl2fastq 2.0 ローカルストレージ NextSeq 34

35 参考 / データベース NextSeq500の仕様等各アプリケーションのデータシート MiSeq/NextSeq500/HiSeq シリーズについての比較デモデータ BaseSpace 上にアップされているデータをご覧いただけます検索欄で NextSeq とご入力ください 35

36 ご清聴ありがとうございましたご質問はでも承ります 36

37 Questions? 37

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Microsoft PowerPoint - 社外資料_TruSeq Synthetic Long-Read DNA Library Prep.pptx TruSeq Synthetic Long- Read DNA ライブラリー調製キットイルミナ株式会社マーケティング部 2014 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, IlluminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadArray, BlueFish, BeadXpress, BlueFuse, cbot,