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1 イルミナ NGS でロングリードを可能にする TruSeq Synthetic Long-Read ライブラリー調製キット : ワークフローのご紹介および注意点 November 28, 2014 崎川真里イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners. 1

2 本日の Outline はじめに プロトコール Best Practice とトラブルシューティング HiSeq のランのセットアップと BaseSpace での解析 2

3 はじめに TruSeq Synthetic Long Read のご紹介 1 つのキットで複数のアプリケーションに対応 Long Reads 複数のアプリケーションをサポート ( ゲノムフィニッシング メタゲノミクス de novo アセンブリ ロングリードやショートリードでのメタアセンブリ ). HiSeq システムによる クオリティの高い 10Kb のリード ショートリードをロングリードへと高精度にアセンブルする Phasing 多型を見る異なる手法 ; 相同染色体の固有のハプロタイプコンテンツを調べる ヘテロザイガス SNP とインデルの 94% 以上を 1 回のアッセイでフェージング 3

4 試薬キットの内容 Library Prep kit + Barcoding kit TruSeq SYNTH Long-Reads DNA Library Prep Kit (4 samples) FC TruSeq SYNTH Long-Reads Barcode Kit (1 samples) - FC or (4 samples) - FC 出荷は室温保管は 2-8 出荷 / 保管 -25 ~ -15 出荷は室温保管は 2-8 出荷 / 保管室温 出荷 / 保管 -25 ~ -15 4

5 アッセイのワークフロー 3 日間のワークフロー 5

6 6 プロトコール Best Practices とトラブルシューティング

7 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part kb の断片を得るゲノム DNA を断片化した後 末端修復 アダプター付加を経て約 8-10kb のサイズの DNA 分子を回収する Part 2 - Long range PCR 約 8-10kb の DNA 分子を希釈して 384 ウェルに分注し 各ウェルで少数分子由来の DNA 分子を増幅する Part 3 短い DNA ライブラリーの作製 Long range PCR 産物を利用する 各ウェル固有のインデックス配列をもち かつシーケンスに必要なアダプター配列をもつライブラリーを作成する 最終的に 384 ウェル分をプールし 精製 サイズ選択を行う HiSeq でシーケンスを行う 7

8 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part kb の断片を得るゲノム DNA を断片化した後 末端修復 アダプター付加を経て約 8-10kb のサイズの DNA 分子を回収する 8

9 Part kb の断片を得る input DNA の品質チェック 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 100~500ngのゲノムDNAを1kbのラダーと共に 0.8% アガロースゲルで泳動する Best Practices Input DNAは濃度 10ng/ulの状態で50ul 用意 (total 500ng) フェノールのコンタミがなく 40kb 以上のサイズが残ったDNAを使用 9

10 Part kb の断片を得る DNA の断片化 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 gdna 8-10 kb の gdna g-tube Best Practices 弊社ユーザーガイドに記載の設定で遠心を行う ( 引用 10

11 Part kb の断片を得る平滑末端化 3 末端への A 付加 アダプター付加 末端修復 - 断片化によって生じた突出末端を End Repair Mix で平滑化する 3 末端への A 付加 - 平滑化した DNA の 3 末端にアデニンを付加する アダプター付加 -Long Range PCR の工程で鋳型増幅に必要なアダプター (11bp のエンドマーカーを含む ) を DNA の両末端に付加する Best Practices 使用するバッファーはよく溶かし混合する 特に指定の無い限り 反応は氷上で行う プロトコールに記載の反応時間と温度を守る サンプル精製は kit に付属の Sample Purification Beads を使用する 8-10kb の gdna 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 エンドマーカーを含むアダプター 11

12 Part kb の断片を得るゲル電気泳動でサイズ選択 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 8-10kbの断片を選択的に回収するゲルでのサイズ選択 E-Gel SYBR Safe gels 0.8% agarose for NGS & QIAQuick Gel Extraction Kit Blue Pippen E-Gel CloneWell 0.8% SYBR Safe gel を用いてサイズ選択を行う 泳動が終了したゲルは E-Gel Opener または Gel Knife で開封する 泳動像をトランスイルミネーターで可視化し X-tracta Gel Extraction Tool で目的のサイズの DNA を切り抜く 切り抜いたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit で DNA を抽出する Qubit dsdna HS Assay kit で定量および Bioanalyzer High Sensitivity chip でサイズ分布を確認する 12

13 Part kb の断片を得る Option1: E-Gel を使用したサイズ選択 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 開封前のプラスチックケース表面 裏面に線を描く サンプルレーン ( レーン2) (A) レーン左端に縦線を引く (B) レーン右端に縦線を引くラダーレーン ( レーン4) (C) 10kbのバンドと水平に横線を引く (D) 8kbのバンドと水平に横線を引く Best Practices E-Gelカセットは室温で保存する (4 保存はしない ) 消費期限切れのE-Gelは使用しない 泳動時間はプロトコール通りに行う DNAの損傷を避けるため その他の泳動装置や染色剤は利用を避ける 13

14 Part kb の断片を得るサンプルの定量とサイズ分布の確認 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 Qubit dsdna HS Assay 期待値 : > 0.05 ng/ul Bioanalyzer High Sensitivity DNA Chip (Optional) 8 kb 10kb の Upper marker と重複する位置にサイズのピークが現れる Troubleshooting 6 kb 小さいサイズに肩がある 適正にサイズ選択をできていないことが原因 14

15 Part kb の断片を得る qpcr での定量 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 Long Range PCRで適切なDNA 量を使用する為に正確な濃度を知る SYBR Green stock を用意する 10,000X ストックをDMSOで100Xに希釈する Nanodropを使用する(Ideal Abs494±3 nm is ) Long qpcr 用にはキットに付属のスタンダードDNA (QST) を使用オーバーナイトで実施 ( 反応時間は7.5 時間以上 ) 94 Cで1 分間 続けて以下の反応を 40サイクル : 94 Cで30 秒間 65 Cで30 秒間 68 Cで 10 分間 Best Practices SYBR Green 100X の濃度は正確に計算する 15

16 Part kb の断片を得る qpcr での定量 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 各 qpcr 装置を使用する (384 ウェル対応である必要はない ) 検量線を使用して定量する場合 手動で検量線を作成し 近似式に Cq 値を代入して濃度を計算する 16

17 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part kb の断片を得るゲノム DNA を断片化した後 末端修復 アダプター付加を経て約 8-10kb のサイズの DNA 分子を回収する Part 2 - Long range PCR 約 8-10kb の DNA 分子を希釈して 384 ウェルに分注し 各ウェルで少数分子由来の DNA 分子を増幅する 17

18 Part 2 - Long range PCR Long range PCRとクオリティチェック 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 ライブラリー調製用のプレートと QC 用のプレートを用意 384 rxn 5 ul MM per well One QC rxn 50 ul MM Workflow DNA Seeding Concentration Number of Cycles Long 3 fg per well 21 cycles Reads Phasing 75 fg per well 15 cycles Best Practices Long Read と Phasing で Long range PCR の条件が異なる ウェルへの DNA のアプライ量が上記と異なると PCR での増幅が適正に行われないので注意 タグメンテーションによる断片化が適正に行われない可能性がある ユーザーガイドに記載の 384 well プレートを使用すること 18

19 Part 2 - Long range PCR 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 Long range PCRとクオリティチェック E-Gel Ex 1% を使用し Long range PCR の QC を行う 384-well plate E-Gel EX 1% 20 ul QC 用に ランダムに 4 ウェルを選び 各ウェルから 5uL 回収して混合する (Pooled sample) Best practice 角や端のサンプルは避ける 回収したウェルを記録しておく QC sample in 96 well plate スタンダード (GTS) Lane 6: Pooled sample Lane 7: QC sample 19

20 Part 2 - Long range PCR 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 Long range PCRとクオリティチェック プールしたサンプル QC 用のサンプル スタンダード (GST 1~4 ) の各バンドは同じ大きさにバンドが出る 10kb のマーカー位置にシングルバンドが見える サンプルのバンドの濃さは スタンダード ( GST1 ~4) の範囲に入る範囲外の場合は 8-10kbに断片化したgDNAのインプット量が正しくない可能性がある qpcrでの定量とlong range PCRを再度実施する 希釈した GST Lane 6: Pooled sample Lane 7: QC Sample

21 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part kb の断片を得るゲノム DNA を断片化した後 末端修復 アダプター付加を経て約 8-10kb のサイズの DNA 分子を回収する Part 2 - Long range PCR 約 8-10kb の DNA 分子を希釈して 384 ウェルに分注し 各ウェルで少数分子由来の DNA 分子を増幅する Part 3 短い DNA ライブラリーの作製 Long range PCR 産物を利用する 各ウェル固有のインデックス配列をもち かつシーケンスに必要なアダプター配列をもつライブラリーを作成する 最終的に 384 ウェル分をプールし 精製 サイズ選択を行う 21

22 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製酵素反応を利用した断片化 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 8-10 kb の DNA トランスポゾン Tagmentation: FPM+TDE Delivery FRP 断片化 Sample Plate (LAP) FRPプレートをPCRプレート (LAPプレート) の上に重ねて操作を行う TDEマスターミックスを作製し FPRプレート各ウェルに3ul 分注する - 電動マルチチャンネルピペットを推奨 -3ulの分注ができるマルチチャンネルピペットでも対応可だが 操作中に溶液が蒸発する恐れがある 酵素プレートを重ねたまま遠心する ( プレート遠心機が必要 ) 22

23 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製酵素反応による断片化 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 FPR プレートには穴が開いているので 遠心すると各ウェルに分注した酵素ミックスが穴から下 (LAP プレート ) に落ちる 遠心することで全ウェルを同時に分注 Best Practices 型番指定の384ウェルプレートを使用するプロトコールの酵素反応条件に従う (DNAの断片サイズに影響) サーマルサイクラ の温度を正しく設定し 断片化の効率を一定にする 23

24 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製各ウェル固有のインデックスプライマーで PCR 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 Indexing PCR: 384 ウェル固有のインデックスをつける IDP Alignment Ring (Optional) インデックス配列を含むプライマーを使用し PCR を実施 Sample Plate (LAP) p7 Index 1 Read 2 Sequencing Primer Read 1 Sequencing Primer Index 2 p5 p7 Index Rd2 1 SP Rd1 SP Index 2 p5 シーケンス可能なライブラリー IDP プレートには予めインデックスプライマーが充填されている タグメント化後の DNA を PCR で増幅し クラスター形成に必要な配列 (P5, P7 配列 ) および 各ウェル固有のインデックス配列を付加する 24

25 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製各ウェル固有のインデックスプライマーで PCR 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 Alignment Ring(Accessory kit) はプレートの位置ずれを防止する目的で利用する オプション品なので必須ではない 型番指定の 384 ウェルプレートを使用すること - 指定品以外はうまく重ならず適切に処理できない Best Practices インデックスを正確な位置に移すため indexing plate (IDP) をしっかりセットする インデックスを移した後は IDP のウェルが空であることを確認する 25

26 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製サンプルプーリングと濃縮 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 底に回収されるサンプル溶液をCollection Plateに回収する型番指定の384ウェルプレートを使用すること - 指定品以外はうまく重ならず適切に処理できない原因となる Zymo カラムにサンプル溶液を通し インデックスが付加したライブラリーを濃縮する バキュームマニフォールドの使用を強く推奨する 26

27 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製磁気ビーズを用いたサイズ選択 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 磁気ビーズを用いたサイズ選択 - マグネットスタンドを使用 - 精製時はチューブまたは プレートどちらを用いても可能 Best Practices 使用前に新しいエタノールを調製する SPB は室温に戻し ビーズをボルテックスでよく撹拌してから使用する プロトコール通りに操作を行う - ビーズの乾燥時間は 37 または 5 分以上行わない - ビーズの量は変更しない ピペットチップの側面にビーズが付いていないことを確認する 最終的に回収するサンプル中にビーズが残らないよう行う 27

28 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製ライブラリーの定量と定性チェック 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 1. 定量は qpcr を利用する KAPA Library Quantification Kit( 日本ジェネティクス社 ) を使用 ( アダプター配列をもち クラスター形成可能なライブラリーのみを定量する 2. Bioanalyzer でライブラリーのサイズを確認する High Sensitivity DNA Chip を使用 最終的なライブラリー KAPA キット付属のサイズスタンダードと 実際のライブラリーサイズは大きく異なる ライブラリーのサイズ分布を Bioanalyzer で確認し 定量値の補正に利用する 28

29 Part 3 短い DNA ライブラリーの作製ライブラリーの定量と定性チェック 8-10kb に断片化 Long range PCR ライブラリ作成 サイズ選択前 サイズ選択後 赤 : Long Reads 青 : Phasing 期待される範囲 : bp Troubleshooting サイズ分布が期待値の範囲外の場合 ( タグメント不良 ) 酵素量とサンプルの比率がタグメント化反応で重要なポイント 384 ウェルプレートへのサンプル投入量が原因 (Long range PCR 前に各ウェルに規定量を投入しているか確認 ) 29

30 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part kb の断片を得るゲノム DNA を断片化した後 末端修復 アダプター付加を経て約 8-10kb のサイズの DNA 分子を回収する Part 2 - Long range PCR 約 8-10kb の DNA 分子を希釈して 384 ウェルに分注し 各ウェルで少数分子由来の DNA 分子を増幅する Part 3 短い DNA ライブラリーの作製 Long range PCR 産物を利用する 各ウェル固有のインデックス配列をもち かつシーケンスに必要なアダプター配列をもつライブラリーを作成する 最終的に 384 ウェル分をプールし 精製 サイズ選択を行う HiSeq でシーケンスを行う 30

31 31 HiSeq のランのセットアップと BaseSpace での解析

32 サンプルシートの作成 シーケンス結果を Base Space 上で解析するために ラン前には IEM でサンプルシートの作成が必須 IEM 1.8 を使用する ワークフローと各設定 HiSeq - FASTQ Only TruSeq Synthetic Long-Read DNA I7_index_ID = TSSLRv1 各ウェル固有のindexは選択しない 32

33 HiSeq Control Software(HCS) でランのセットアップ 33

34 シーケンスの設定と用意するプライマー 各ライブラリーは 下記の通りレーンを使用する v3/v4 Flow cell の場合 フローセルの 1 レーン Rapid flow cell の場合は フローセル 1 枚 (2 レーン分使用 ) Cluster/SBS 試薬キット Dual Indexing primer box Sequencing Recipe 推奨の ライブラリーの最終濃度 (based on qpcr) TruSeq Cluster and SBS Kit v3 TruSeq Cluster and SBS Kit v4 TruSeq Rapid Cluster and SBS kit 必要 HP11 + HP12 不要 (Index 1) pM (Index 1) or (Index 1) pM 不要 (Index 1) pM 参考資料 : TruSeq Synth Long-Read DNA Library Prep Sequencing Insert.pdf 解析のため ラン開始と同時に Base Space 上へのデータの転送が必須 34

35 BaseSpace での解析独自に開発した解析手法 35

36 TruSeq Long Reads Assembly App 解析サマリーページ リードのヒストグラム 出力ファイル Long Read FASTQ (>1.5kb) FASTQ ( kb) Library Characteristics (.csv) ウェルごとのメトリクスの詳細 LongRead Summary report (.pdf) 36

37 TruSeq Phasing Analysis App 解析サマリーページ ヒストグラム 出力ファイル (~500 Mb) Phased.vcf.gz Unphased.vcf.gz Stats.xml Library Characteristics (.csv) PhasingSummary report (.pdf) 37

38 TruSeq Synthetic Long Read の Public Data Base Space で公開 38

39 39 資料 / サポートツールのご紹介 Datasheets: pdf ( 日本語版データシート ) User guide Online Trainings:

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