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1 トラブルシューティング編 Nextera ライブラリー調製キットシリーズで期待通りのライブラリーを得るためのヒント March 6, RevB: 一部修正 小林孝史イルミナ株式会社テクニカルサポート部テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2014 Illumina, Inc. All rights reserved.illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate,HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, ForenSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeqFGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq,TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/orother countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

2 本日のウェビナーの内容 キットの特色 ワークフローのご紹介 注意するべきポイントとして途中でよくいただくお問い合わせにつきまして Quiz としてご案内させていただきます ライブラリーの定量 濃度変換について シーケンサーにかける前に注意すること プロトコールの取得方法 プロトコール上の注意 6

3 本日のウェビナーの内容 キットの特色 ワークフローのご紹介 注意するべきポイントとして途中でよくいただくお問い合わせにつきまして Quiz としてご案内させていただきます ライブラリーの定量 濃度変換について シーケンサーにかける前に注意すること プロトコールの取得方法 プロトコール上の注意 7

4 Nextera キットのワークフロー Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure プロトコールは 大まかに 5 つのステップに分かれます 90 分以内でライブラリー調製が可能です 必要な DNA 量は Nextera DNA キットでは 50ng Nextera XT DNA キットでは 1ng( 定量方法は Qubit/PicoGreen) Covaris による断片化が不必要 マスターミックス試薬のため 試薬の分注が簡単 多サンプル処理や オートメーションも可能 8

5 Nextera と Nextera XT との比較 Sample Input ( 必要 DNA 量 ) Tagmentation ( タグ付断片化 ) Cleanup (Transposome の除去 ) PCR (Index 付加と増幅 ) AMPure ( 必要なビーズ量 ) Validation ( ライブラリーの評価 ) Nextera DNA 50ng Zymo Nextera DNA index adapter; PCR: 5 cycles Tm: 63ºC 0.6x 0.5x: 2x250bp/ 2x300bp MiSeq Qubit/PicoGreen + Bioanalyzer Nextera XT 1ng Neutralize Tagment Buffer Nextera XT index adapter; PCR: 12 cycles Tm: 55ºC < 300bp -> 1.8x < 500bp -> 1.8x > 500bp -> 0.6x -> 0.5x: 2x250bp 2x300bp MiSeq 不要 Normalization Beads 使用時 PCR cleanup 後 : Qubit/PicoGreen + Bioanalyzer (high-sensitivity Chip 使用!) 9

6 10 Nextera キットと Nextera XT キットの相違 ( 推奨 )

7 PCR Amplicon に対して使用する場合両端 50~100bp のカバレッジは小さくなる傾向があります トランスポゾンが DNA の両端に対して作用する 両末端のカバレッジが低くなる Index 2 Index 1 参考文献 : Nextera XT sample prep kit product data sheet 11

8 Nextera XT DNA sample prep に必要なキット Nextera XT DNA Sample Prep kit 24 samples FC samples FC 試薬類がパッケージ Nextera XT Index Kit 24 Indices, 96 samples FC Indices, 384 samples FC サンプルを調製するだけの際も必要 P5/P7 領域 Index Tag 領域を含むプライマー Nextera XT v2 Index Kit 96 Indices, 384 samples (Set A-Dをすべて購入いただくと独立した384 インデックス ) (FC /2002/2003/2004) HiSeq V3 と GA 使用の場合は必要 TruSeq Dual Index Sequencing Primers Single Read Run FC Paired End Run PE シーケンサーで解析するためのシーケンスプライマー 12

9 Nextera DNA sample prep に必要なキット Nextera DNA Sample Prep kit 24 samples FC samples FC 試薬類がパッケージ Nextera DNA Index Kit 24 Indices, 96 samples FC Indices, 384 samples FC サンプルを調製するだけの際も必要 P5/P7 領域 Index Tag 領域を含むプライマー HiSeq V3 と GA 使用の場合は必要 TruSeq Dual Index Sequencing Primers Single Read Run FC Paired End Run PE シーケンサーで解析するためのシーケンスプライマー 13

10 本日のウェビナーの内容 キットの特色 ワークフローのご紹介 注意するべきポイントとして途中でよくいただくお問い合わせにつきまして Quiz としてご案内させていただきます ライブラリーの定量 濃度変換について シーケンサーにかける前に注意すること プロトコールの取得方法 プロトコール上の注意 14

11 キットに使用する DNA サンプル (Input DNA) について プロトコール : 精製度の高い高品質な DNA を使用 : 1ng (Nextera XT) / 50ng (Nextera) DNA は 300bp 以上 ( 推奨 1kb 以上 ) 短い DNA の場合はカバレッジが不均一になる可能性があります 両端 50~100bp のカバレッジは小さくなる傾向があります 注意するポイント : 二本鎖 DNA 特異的な定量方法 ( 例 :Qubit/Picogreen あるいは QuantiFluor) Quality Check はゲル泳動あるいは A 260/280 で測定 (1.8-2 の範囲 ) ピペットのキャリブレーションをしておく Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure

12 プロトコール : Tagmentation 5 min at 55 の反応 XT DNA: 5uL DNA (at 0.2ng/uL) + 10uL Buffer + 5uL transposome = 20uL total DNA: 20uL DNA (at 2.5ng/uL) + 25uL Buffer + 5uL transposome = 50uL total transposomes gdna Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 16

13 プロトコール : Tagmentation 5 min at 55 の反応 XT DNA: 5uL DNA (at 0.2ng/uL) + 10uL Buffer + 5uL transposome = 20uL total DNA: 20uL DNA (at 2.5ng/uL) + 25uL Buffer + 5uL transposome = 50uL total transposomes gdna 前後 19base を認識 Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 17

14 Protocol: Tagmentation 5 min at 55 の反応 XT DNA: 5uL DNA (at 0.2ng/uL) + 10uL Buffer + 5uL transposome = 20uL total DNA: 20uL DNA (at 2.5ng/uL) + 25uL Buffer + 5uL transposome = 50uL total transposomes gdna Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 18

15 Protocol: Tagmentation 5 min at 55 の反応 Nextera XT DNA: 5uL DNA (at 0.2ng/uL) + 10uL Buffer + 5uL transposome = 20uL total Nextera DNA: 20uL DNA (at 2.5ng/uL) + 25uL Buffer + 5uL transposome = 50uL total Best Practices: 5 分の反応の後には 10 で保温 注意!: トランスポソームは 10 でも活性を残し tagmentation を続けます すぐに次のポイントに進む必要がある Nextera XT では Neutralize Nextera では Zymo cleanup でトランスポソームを失活除去します PCR 装置 ヒートブロックの温度が正確でない場合に tagmentation がうまく進まない / 進みすぎることがある ( その後の増幅工程にも影響 ) 設定を正確にする Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 19

16 Overtagmentation( 断片化されすぎ ) Input DNA = 50ng 最終ライブラリーサイズ分布 Input DNA < 50ng 最終ライブラリーサイズ分布 サンプル量が 50ng (2.5ng/uL, Nextera) より少ないとインサートサイズが小さくなる (=over-tagmentation) Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 20

17 Undertagmentation ( 断片化不十分 ) Input DNA = 50ng 最終ライブラリーサイズ分布 Input DNA > 50ng 最終ライブラリーサイズ分布 サンプル量が 50ng (2.5ng/uL, Nextera) より多いとインサートサイズが大きくなる (=under-tagmentation) Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 21

18 Quiz1 Quiz Tagmentation 時に Undertagmentation になるようです 反応時間を長くしていいですか? 22

19 Ans1: No! プロトコールにできる限り従ってください Quiz Undertagmentation が生じる場合 まずは夾雑物のチェック あるいは定量結果が正しいかを疑ってください プロトコールに比べて短い ( 長い ) 断片が欲しい場合は インプット量を調節して時間は変えない方向で調節ください 23

20 Tagmentation: 夾雑物に気を付ける Quiz o Input DNA は高精製 純水 (milliq) か Tris buffer (10 mm PH8.5) に溶解されている o A 260:280 が (Nanodrop などで ) 24

21 Protocol: Cleanup カラム精製 (Nextera)/ 中和反応 (Nextera XT) で tagmentation 反応を止め PCR 増幅前に DNA 断片を精製する 溶出液 20uL を次の PCR ステップに使用する Best Practices: ウォッシュバッファーは用事調製したエタノール溶液を使用 エタノール濃度が適正でないと Transposome がのぞけない PCR 増幅がうまくかからない Bioanalyzer (1uL アプライ ) で溶出液は 150bp~1.5kb にピークを示します 遠心強度 (1300xg) を厳守します ( 収量を減らす可能性があります ) Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 25

22 Protocol: PCR 増幅 4 つのプライマーで行う 5 cycle (Nextera)/12 cycle (Nextera XT) の PCR 反応 2 つの index プライマーを添加!( プーリングしなくても ) Index キットのプライマーには P5/P7( フローセルに結合する部分 ) がついているので必ず必要な作業 PCR Mix (PPC and NPM) にも P5/P7 配列を含むプライマーが入っており全体のライブラリーを増幅する Added by primer from Index kit Added by primer from Index kit P7 Index 1 Rd1seqprimer Index 2 Rd2seqprimer P5 Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 26

23 PCR 増幅 P5 Index 2 Index 1 P7 Index プライマーには 2 種類のインデックスが付属しており計 96/384 種類の組み合わせ可能 独立した96 種類のバーコード化が可能 20 チューブのみ (12 Index 1 x 8 Index 2) Plate Fixtureでハンドリングが安心 MiSeq Reporter/bcl2fastq/CASAVAで振り分けまでサポート Illumina Experiment Manager でサンプルシートを作成 インデックスの組み合わせもチェック可能 (~IEM1.6に限られます) 27

24 PCR 増幅 1. Add i7 primers to PCR plate 2. Add i5 primers to same plate 3. Add Nextera PCR Master Mix 4. Add PCR Primer Cocktail 5. Add tagmented DNA 6. Mix, seal, and spin 7. Perform PCR P5/P7 配列を負荷するためインデックスを読まない場合でも Nextera Index Kit が必要です! 72ºC 3min Fills in 9bp gaps 98ºC 98ºC 63ºC: Nextera 30s 10s 55ºC: Nextera XT 72ºC 3min 30s x 5 cycles: Nextera X12cycles: Nextera XT 10ºC p7 Index 1 Read 2 Sequencing Primer Read 1 Sequencing Primer Index 2 p5 28

25 プロトコール : PCR 増幅 4 つのプライマーで行う 5 cycle (Nextera)/12 cycle (Nextera XT) の PCR 反応 2 つの index プライマーを添加!( インデックスを読まなくても必要です ) Index キットのプライマーには P5/P7( フローセルに結合する部分 ) がついているので必ず必要な作業 PCR Mix (PPC and NPM) にも P5/P7 配列を含むプライマーが入っており全体のライブラリーを増幅する Best Practices ヒートリッド付きの PCR 装置を使用してください その他の PCR 装置では収量が悪くなる可能性があります PCR 装置の温度調整が正確かを確認ください Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 29

26 Cleanup と PCR PCR 後にはアダプターが付加するため 68bp 長さが大きくなる トランスポゾーム中にアダプターの一部の配列が含まれるため (tag の部分 ) アダプターダイマーは TruSeq タイプよりも短くなる Zymo clean-up (Nextera) または Neutralization 反応 (Nextera XT) が適正に行われていない場合は ライブラリーの収量が少なく ( あるいは完全に消失 ) なり 55-60bp の PCR プライマーダイマーが生じる可能性があります Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 30

27 Quiz2 Quiz Kit で所定のサイクル数では収量が確保できません サイクル数を上げて収量を多くしてもいいですか? 31

28 Ans2: No! Quiz Tagmentation 後には 3 種類のプロダクトができている 正しい形のライブラリー それぞれを鋳型にした PCR 反応でも 3 つのプロダクトが産生される可能性がある A B N701-N712 B A A N501-N508 B 32

29 小さいサイクル数だと両端に異なるアダプターを持つものが優先的に増幅される 分子内アニールする Tm 値が PCR プライマーよりも高い サイクル数が増えると他のサブタイプも増幅される A B A A B B 結論 : PCR のサイクル数は収量が悪い場合でも変えないでください! 33

30 AMPure Clean-up Protocol: 50uL sample + 30uL AMPure beads 25uL AMPure beads (Nextera DNA で 2x250bp か 2x300bp の MiSeq ラン ) Nextera XT のビーズ精製はサイズによって異なるので注意 Magnetic stand = Ambion, part #AM10027 Best Practices: 用事調製した 80% エタノール溶液を使用 古いエタノールを使用するとウォッシュの効率および収量が悪くなる ビーズの容量を守る ( 回収されるサイズが変わるため ) チップの中に泡やつまりなどがないようにチェック チップの中にビーズが残らないようにピペッティングを丁寧に行う プロトコールで指定された Magnetic stand を使用する ( ビーズのロス キャリーオーバーをなくすため ) Sample Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 34

31 本日のウェビナーの内容 キットの特色 ワークフローのご紹介 注意するべきポイントとして途中でよくいただくお問い合わせにつきまして Quiz としてご案内させていただきます ライブラリーの定量 濃度変換について シーケンサーにかける前に注意すること プロトコールの取得方法 プロトコール上の注意 35

32 Library 定量 二本鎖 DNA 特異的な定量方法 ( 例 :Picogreen と Qubit あるいは QuantiFluor) を使用 下記のようなトレースであったら ( bp にピークがあるが bp にブロード ), 1ng/uL=3nM conversion factor で濃度換算する Example: サンプルが Qubit で 12ng/uL であったら 12ng/uL X 3nM 1ng/uL = 終濃度 36nM 36

33 Library 定量 下記のようなトレースであったら ( bp にピークがあるが bp にブロード ), 1ng/uL=3nM conversion factor で濃度換算する 1ng/uL=3nM / (library average size in bp /500bp) Example: サンプルが Qubit で 12ng/uL であったら 平均ライブラリーサイズが 900bp 37

34 Library 定量 下記のようなトレースであったら ( bp にピークがあるが bp にブロード ), 1ng/uL=3nM conversion factor で濃度換算する 1ng/uL=3nM / (library average size in bp /500bp) Example: ~900bp サンプルが Qubit で 12ng/uL であったら 1ng/uL = 3nM (900/500) = 1.67nM conversion factor 38

35 Library 定量 1ng/uL = 3nM (900/500) = 1.67nM conversion factor Example: ~900bp サンプルが Qubit で 12ng/uL であったら 12ng/uL X 1.67nM 1ng/uL = 終濃度 20nM 39

36 Library 定量 : Technical Note を参照ください 平均サイズ 500b 1ng/uL=3nM 平均サイズ 1kb 1ng/uL=1.5nM 40

37 NexteraXT キットの場合は Normalization beads により濃度調整できる ( 多数サンプル解析向け ) qpcr に持ち込まずすぐに MiSeq へ! 濃度が異なるライブラリー Index CV for 20-sample pools Pool A Pool B qpcr で定量 (Triplicate) 希釈率を計算 マニュアル作業で希釈とサンプルのプール 15.8% 18.2% 5 µl ずつのライブラリーをプールして直接アプライ! Normalization beads で処理 : Bind, Wash, Elute 13.5% 15.5% Nextera XT を使えばサンプルの変性ステップを省略可能! ( 少量サンプルの場合 マニュアルで変性希釈することも可能です ) 41

38 Quiz3 Quiz Nextera XT ライブラリーを Qubit で計測したら収量が小さすぎます どこかハンドリングが悪いのでしょうか? 42

39 Ans3: 正常です 濃度が異なるライブラリー Quiz Index CV for 20-sample pools Pool A Pool B qpcr で定量 (Triplicate) 希釈率を計算 マニュアル作業で希釈とサンプルのプール 15.8% 18.2% 5 µl ずつのライブラリーをプールして直接アプライ! Normalization beads で処理 : Bind, Wash, Elute 13.5% 15.5% Nextera XT kit では ライブラリーが Normalization beads からの溶出時に NaOH で変性されます したがって 得られるライブラリーは ssdna となり Qubit で測れません 結論 : Nextera XT ライブラリーは最終産物を定量しないプロトコールになります ただ 最初の実験の場合など定量する必要がある場合は qpcr をご使用ください あるいは Normalization beads を使用せず変性 + プールください 43

40 本日のウェビナーの内容 キットの特色 ワークフローのご紹介 注意するべきポイントとして途中でよくいただくお問い合わせにつきまして Quiz としてご案内させていただきます ライブラリーの定量 濃度変換について シーケンサーにかける前に注意すること プロトコールの取得方法 プロトコール上の注意 44

41 Index の読み合わせ (NextSeq500 を除くイルミナ NGS) POOLING GUIDELINES: 1サイクルで緑蛍光 赤蛍光がそれぞれ1 色ずつ必要 ( 緑蛍光 = G/T; 赤蛍光 = A/C) Pooling 6 samples: シングルインデックスでかける Pooling > 6: シングルかデュアルかどちらかでかけるが組合せを意識する MiSeq Control Software 2.2/HiSeq Control Software 以上ではバランスの悪いインデックスでも可能だが 一部の視野でオーバークラスターになるのを避けるため塩基はバランスを考慮したほうがクオリティーが良くなります 45

42 Quiz4 Quiz TruSeq ライブラリーと Nextera ライブラリーを混ぜて ( プールして ) 解析したいです 可能でしょうか? 46

43 Ans4: できれば別なレーンで流してください Quiz Nextera ライブラリーは TruSeq ライブラリーと 同時に解析できますか?: 同じレーン : No! 弊社では異なる種類のライブラリーを同じレーンで解析することをお勧めしておりません - ライブラリーの長さが異なるとクラスターの径が異なり FWHMが不安定 クオリティーに影響を与える - Indexの組み合わせをチェックする必要あり 同じフローセル : Yes! インデックスの振り分けのパイプラインはご用意ください 47

44 [ まとめ ] Nextera と Nextera XT との比較 Sample Input ( 必要 DNA 量 ) Tagmentation ( タグ付断片化 ) Cleanup (Transposome の除去 ) PCR (Index 付加と増幅 ) AMPure ( 必要なビーズ量 ) Validation ( ライブラリーの評価 ) Nextera DNA 50ng Zymo Nextera DNA index adapter; PCR: 5 cycles Tm: 63ºC 0.6x 0.5x: 2x250bp/ 2x300bp MiSeq Qubit/PicoGreen + Bioanalyzer Nextera XT 1ng Neutralize Tagment Buffer Nextera XT index adapter; PCR: 12 cycles Tm: 55ºC < 300bp -> 1.8x < 500bp -> 1.8x > 500bp -> 0.6x -> 0.5x: 2x250bp 2x300bp MiSeq 不要 Normalization Beads 使用時 PCR cleanup 後 : Qubit/PicoGreen + Bioanalyzer (high-sensitivity Chip 使用!) 48

45 [ まとめ ] 最終ライブラリー Quality Check トラブルシューティング対象ステップ Input Tagmentation Cleanup PCR AMPure 原因 ピーク無し 55bp のみピーク AMPure 精製時にすべてのサンプルを失っている プライマーのみみられるので PCR に持ち込む前のステップでサンプルをロスしている サンプルのピークの他に 55bp のピーク インプット量を確認 ( 正確に定量 ) ピペッティングを正確に ピークが高すぎる 低すぎる インプット量を確認 ( 正確に定量 ) Tagmentation 時の条件を再確認 ヒートブロックの調整 49

46 本日のウェビナーの内容 キットの特色 ワークフローのご紹介 注意するべきポイントとして途中でよくいただくお問い合わせにつきまして Quiz としてご案内させていただきます ライブラリーの定量 濃度変換について シーケンサーにかける前に注意すること プロトコールの取得方法 プロトコール上の注意 50

47 ご使用前には説明書をご用意ください 2 つの説明書があります 製品のサポートページでダウンロードできます Nextera DNA: Nextera XT: Userguide: 細かい手順をご案内した資料 取扱説明書 Nextera DNA Nextera XT Experienced User Card: ベンチ横に置くプロトコール Nextera DNA Nextera XT 51

48 その他の資料を参照ください Lab Tracking Form: 使用した試薬の Lot などを記録する用紙 Nextera DNA Nextera XT 必要な消耗品 装置類のリストはユーザーガイドの最後に Consumables and Equipment として掲載しております 52

49 中断できるステップを確認ください 時計のマークの入っているステップで止める 保存条件に従う 53

50 弊社のサポートページには種々の情報が掲載されております ご利用ください Technical Notes: Nextera Library Validation and Cluster Density Optimization Nextera Low Plex Pooling Guidelines Support Bulletins: Nextera Bioanalyzer traces and sequenced insert size: a comparison Considerations for DNA isolation when using Nextera kits Decreasing DNA input amount leads to shorter inserts for Nextera DNA Libraries Pool up to 384 Samples with Nextera XT Nextera Tagmentation Troubleshooting New Online Troubleshooting Tools for Nextera DNA and TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kits 54

51 55 ご清聴ありがとうございました しばらくご質問を承ります