Microsoft PowerPoint - Final _LibraryQC_andTroubleshooting_August2013

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1 BioAnayzer を使用した Library QC と トラブルシューティング 田中敦成イルミナ株式会社 テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Iumina, Inc. A rights reserved. Iumina, iuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Anayzer, GenomeStudio, GodenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iseect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Soexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange coor, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Iumina, Inc. A other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 概要 どのようにして BioAnayzer を ibrary QC のためのツールとして使うのか 最終ライブラリーの理想的なトレースとは 起こりうる問題点とは 起こってしまった問題点の解決法と回避方法 2

3 トラブルシューティングの内容 理想的なトレースとは? 理想的な最終ライブラリーのトレースとは? サンプルのオーバーロード 小さすぎるライブラリー 大きすぎるライブラリー 予想される産物が回収されない AMPure の持ち越み PCR artifacts アダプターダイマー プライマーダイマー 3

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5 BioAnayzer での解析に適したサンプル マーカー 適切な範囲 マーカー 平らなベースライン 5

6 理想的なトレース : TruSeq TruSeq DNA- ge seection TruSeq DNA- ge free (TruSeq Enrichment) TruSeq ChIP TruSeq RNA 6

7 理想的なトレース : TruSeq Nano TruSeq Nano キットは SPB ビーズによるサイズセレクションがある 最終ライブラリーにはインサートと ~120 bp (LT) もしくは ~135 bp(ht) のアダプターが含まれる 350 bp インサート + ~130bp アダプター 550 bp インサート + ~130bp アダプター 7

8 理想的なトレース : TruSeq PCR-Free 350 bp insert 550 bp insert ~ 1 kb ~ 5 kb 最終ライブラリーの トレース ~350 bp ~550 bp シーケンス結果から 得られた平均イン サートサイズ 8

9 理想的なトレース : TruSeq Sma RNA 対象となる sma RNA: 22nt と 30nt ゲルからの切り出し精製をする範囲 : ~ bp 145 bp Fina ibrary ~ bp 160 bp 9

10 理想的なトレース : Nextera 丸いピーク なだらかなピーク 10

11 Bioanayzer を用いたトラブルシューティング サンプルのピークがある 多くのケースではシーケンス可能 サンプルピークがない 再調整が必要 11

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13 : サンプルのオーバーロード 適切な範囲 オーバーロード 解決法 : サンプルを希釈したのち 再解析 13

14 異常なピーク : Nextera 14

15 : Nextera 小さすぎるサンプル Tagmentation 過多原因 : インプットDNA 量が少なすぎる回避方法 : DNA 量を正確に定量する 15

16 異常なピーク : Nextera 大きすぎるサンプル Tagmentation 不足原因 : インプット DNA 量が多すぎる回避方法 :DNA を希釈する ~1 kb 16

17 異常なピーク : Nextera 大きすぎるサンプル 最終ライブラリーの Bioanayzer のトレースは違うが シーケンスの解析結果には大きな影響を与えない 25ng インプット 50ng インプット 平均ライブラリーサイズ : 500bp 平均ライブラリーサイズ : 1kb 17

18 異常なピーク : Nextera 大きすぎるサンプル インプット DNA ライブラリーサイズの中央値 BioAnayzer (bp) インサートサイズの中央値 Sequencing (bp) Diversity (# of Unique Bases) 25ng X ng X10 9 *sequence data performed in dupicate (50ng) and tripicate (25ng) 最終ライブラリーのトレースは違うが シーケンスの解析結果には大きな影響を与えない Bioanayzer は tagmentation が行われたことの検証用に使う 多少異なる DNA サイズでもシーケンスデータに大きな影響を与えない 18

19 異常なピーク : Nextera 大きすぎるサンプル タグメンテーション不足原因 :tagmentation 酵素が阻害されている 19

20 異常なピーク : Nextera 大きすぎるサンプル DNA 精製キットから混入しうる tagmentation 酵素の阻害物質 20

21 異常なピーク : TruSeq 21

22 異常なピーク : TruSeq DNA 小さすぎるサンプル SYBR God, 後染色 ge sice 290 bp SYBR God, 前染色 ge sice 340 bp 正確なサイズセレクションのためには SYBR God で前染色したゲルが必要 22

23 異常なピーク : TruSeq 小さすぎるサンプル ゲルの条件が違うとライブラリーラダーマーカーの泳動度に影響が出る Post-staining SYBR Green Ethidium Bromide E-ges Pippin Prep ゲルの条件をプルトコルに沿って選ぶ 23

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25 : TruSeq sma RNA Sma RNA 由来の bp ピークが見えない本キットにより sma RNA が回収されなかった 25

26 : TruSeq sma RNA Sma RNA 由来の bp ピークが見えない本キットにより sma RNA が回収されなかった 起こりえる原因 質の低いインプット アダプターオリゴの二次構造の形成 Sma RNA が 精製した RNA 中に存在しない 解決策 高品質な RNA を確保するためにインプットの QC をする 70 C で温めた直後に氷上に移す Sma RNA の精製に対応したキットを使う 26

27 : TruSeq and Nextera ライブラリーのピークが見えない もしくはダイマーのピークしか見えない シークエンスすべきではない 27

28 起こりえる原因 質の低いインプットもしくは量が不十分 ビーズ精製時のサンプルの喪失 Thermocycer の蓋が加温されていない 不完全な fragmentation 酵素の劣化 解決策 Picogreen や Qubit を用いてインプットの QC をする Best practices の手法に従う Thermocycer が室度以上に加温時される時は 蓋の温度を 100 にする Fragmentation 後のサイズ分布をチェックする 酵素を消費期限内に使用する 凍結融解をしない 28

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30 AMPure bead の持ち込み Large traiing hump 解決策 : サンプルが透明になるまで磁石の上に静置したのち ライブラリーを回収する回避方法 : AMPure beads 使用時に best practices に従う 30

31 PCR artifacts 目的産物 二次的な産物 31

32 PCR artifacts Overampified bubbe 目的産物 目的産物 二次的な産物 Overampification による Artifact ピーク PCR 反応に必要な試薬が枯渇すると, 相補的でないライブラリー鎖が末端にある相補的なアダプターでアニールする Semi-singe stranded product ができる 32

33 PCR artifacts Overampified bubbe 目的産物 目的産物 二次的な産物 確認方法 : サンプルを 95 5 分間再加熱したのち ヒートブロック中でゆっくり室温にする サンプルのサイズがシフトするかどうかを調べる 回避方法 : PCR サイクルを減少させる インプット量を減少させる 33

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35 : TruSeq アダプターダイマー ~120bp 解決策 : 再精製回避方法 : 適切なインプット量 35

36 : Nextera プライマーダイマー 原因 : インプット DNA が少なすぎる ~45bp 回避方法 : 適切な量のインプットを使用する 36

37 本日のまとめ 理想的なトレース : 平坦なベースライン, マーカーの範囲内サンプル量とサイズ オーバーロード : サンプル量がマーカーよりも多い. 再希釈する サンプルが小さすぎる : ゲルの条件が違う (T), タグメンテーション過多 (N) サンプル量を増やす サンプルが大きすぎる : タグメンテーション不足 (N), 酵素の阻害剤の存在を疑う ピークが 1kbp ぐらいまでならシーケンス可能 反応産物が回収できない サンプルに合ったキットを選ぶ. 調製時にサンプルがなくなる すべてのステップでサンプルを確認する ライブラリーの再調製が必要 AMPure の持ち込み : 1kb を超えるこぶのようなピーク, 再精製し 再ラン PCR artifacts: overampification, サンプルを再加熱し サンプルのシフトを確認する シーケンス可能 アダプターダイマー ~120bp (T) プライマーダイマー ~45bp (N) (T) TruSeq (N) Nextera 37

38 38 Questions?

39 ご清聴ありがとうございました ご質問は でも承ります 39