優れたエクソームシーケンスをIDT 社Exome Panel とイルミナ社Library Prep kit で実現

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あまめこいたばし
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1 --- 優れたエクソームシーケンスを IDT 社 Exome Panel とイルミナ社 Library Prep kit で実現 --- Integrated DNA technologies 株式会社統括本部長矢野実 1

2 Integrated DNA Technologies (IDT) 1987 年に現 CEO の Dr. Joseph Walder (M.D. PhD) により設立現在世界最大級の研究用カスタム核酸合成品のサプライヤー世界の 4 ヶ所 ( 米国 2 欧州 1 アジア 1) に製造拠点 00 台以上の合成機器が稼動従業員はグローバルで 1,000 人以上 2016 年より Integrated DNA Technologies 株式会社 (IDT KK) が日本の輸入販売元に 2

3 Integrated DNA Technologies (IDT) List of Products : 研究用の核酸合成品ほぼ全てカスタムDNA 合成 : カスタムプライマー修飾オリゴ合成 Ultramer カスタムRNA 合成 : 1 本鎖合成 Ultramer DsiRNA 人工遺伝子合成 : gblocks Genes 定量 PCRプローブ : PrimeTime ゲノム編集 : Alt-R CRISPR-Cas9 System 次世代シーケンス : xgen

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5 1. IDT-illumina Exome Sequencing Solution 2. xgen プローブの特徴. xgen Exome Research Panel. xgen Blocking Oligos 4. xgen Lockdown Reagents (Hybridization and wash kit). マルチプレックス化コスト低減 6. IDT 社のオリゴ合成技術 7. IDT-illumina Exome Sequencing 性能検証データ

6 Exome Sequencing 全エクソンもしくはタンパク質をコードする領域のみをシーケンスする遺伝性疾患研究やがん研究に至るまで幅広い研究領域で関連遺伝子を網羅的に探索するための方法 6

7 IDT-illumina Exome Sequencing Solution illumina IDT illumina illumina xgen products を用いる 7

8 xgen Products for NGS target capture enrichment xgen R Lockdown R Reagents 8

9 1. IDT-illumina Exome Sequencing Solution 2. xgen プローブの特徴. xgen Exome Research Panel. xgen Blocking Oligos 4. xgen Lockdown Reagents (Hybridization and wash kit). マルチプレックス化コスト低減 6. IDT 社のオリゴ合成技術 7. IDT-illumina Exome Sequencing 性能検証データ 9

10 xgen プローブの特徴 120basesの末端ビオチン修飾 DNAオリゴ各プローブは1 本づつ合成され 1 本づつ品質管理チェック質量分析による分子量測定で配列確認する OD 値測定により収量 ( モル数 ) を同定する図. GC 含量 78% プローブの質量分析結果合成した配列 /Biosg/GCGGCGAGCGGAGATCCGGGGCCTGCGCTGCGCACTCGAGCCTGGC GGGCCGGCACGGTGCGGGCCATGAGCGGGGCGGTGCCCCAGGACCTAGCG GTGAGTGGCGGCCGAGTCGGGCAC 10

11 xgen プローブを用いるパネルの特徴各プローブは1 本づつ合成され 1 本づつ品質管理チェックパネルに正しい配列互いに等量必要量のプローブがプールできるライブラリーからキャプチャーしたい断片を正しくキャプチャーできるより良い品質の配列解析データを得ることができる高いon-target 率高いカバレッジと均一性 GC rich 領域でもキャプチャー可能 ( 例 : 第一エクソン ) 11

Foundation Medicine 社におけるキャプチャープローブ検討実験結果 IDT 社のテクニカルレポート Delivering Comprehensive Genomic Profiling for Clinical Cancer Care http://sg.idtdna.

12 Foundation Medicine 社におけるキャプチャープローブ検討実験結果 IDT 社のテクニカルレポート Delivering Comprehensive Genomic Profiling for Clinical Cancer Care coded-articles/yourresearch/decoded/201/0/0/deliverin g-comprehensive-genomic-profiling-forclinical-cancer-care IDT foundationone で検索 Foundation Medicine 社はターゲットエンリッチメントに xgen プローブを採用 12

13 1. IDT-illumina Exome Sequencing Solution 2. xgen プローブの特徴. xgen Exome Research Panel. xgen Blocking Oligos 4. xgen Lockdown Reagents (Hybridization and wash kit). マルチプレックス化コスト低減 6. IDT 社のオリゴ合成技術 7. IDT-illumina Exome Sequencing 性能検証データ 1

14 xgen Exome Research Panel とはスペックヒトの 19,96 遺伝子のエクソンのコーディング領域がターゲット 9 Mb のターゲット領域 1Mb のカバー領域 429,826 本のプローブをプール hg19 データベースを基にプローブ配列デザイン特徴 1. 高い on-target 率 2. 高いカバレッジと均一性. GC rich 領域でもキャプチャー可能 ( 例 : 第一エクソン ) 2018 年月 1 日現在の価格です 14

15 各社 Exome Panel の比較検討実験 : スキーム 1. KAPA Hyper Prep kit を使用して 12 種のライブラリを用意しプレプール 2. 各社キャプチャー用に分配. 各社推奨のプロトコールに従ってキャプチャー (12-plex) 4. HiSeq 200 の high output で 10bp ペアエンドシーケンスを行い 4M リード (17M ペアエンド ) を取得 2016 年に米国の大規模シーケンスセンターで得られたデータです 1

16 各社 Exome Panel の比較検討実験 : 各パネルの概要 Database / Probe space xgen panel % Database covered Vendor R Vendor A Vendor I (Size bp) (1 Mb) (4 Mb) (4 Mb) (4 Mb) RefSeq (4 Mb) 98% 97% 97% 100% CCDS (2 Mb) 99% 98% 98% 100% Ensembl ( Mb) 9% 92% 96% 99% GENCODE ( Mb) 96% 9% 97% 99% Vega (26 Mb) 9% 96% 97% 100% 16

17 xgen Exome Research Panel: 高い on-target 率 On-target (%) = (on bait bases + near bait bases) / aligned bases 17

18 xgen Exome Research Panel: 高いカバレッジと均一性 xgen はカバレッジが低い領域が少なく頻度ピーク時のカバレッジ数が高い xgen は 20x カバレッジのカバー率が 9% に対して他のパネルは 71% 以下 18

19 xgen Exome Research Panel: GC rich 領域でもキャプチャー可能 ( 例 : 第一エクソン ) 19

20 1. IDT-illumina Exome Sequencing Solution 2. xgen プローブの特徴. xgen Exome Research Panel. xgen Blocking Oligos 4. xgen Lockdown Reagents (Hybridization and wash kit). マルチプレックス化コスト低減 6. IDT 社のオリゴ合成技術 7. IDT-illumina Exome Sequencing 性能検証データ 20

21 xgen Blocking Oligos: 高いオンターゲット率に必須 Blocking Oligos を使用するアダプター配列が Blocking Oligos でマスクされるオフターゲット配列の回収率が下がる Blocking Oligos を使用しないアダプター配列介し非特異断片が結合オフターゲット配列の回収率が上がる xgen Blocking Oligos 2018 年月 1 日現在の価格です 21

22 xgen Blocking Oligos: イノシン塩基を用いマルチプレックスに対応インデックス配列部分にはイノシン塩基が結合するよう設計されておりマルチプレックス実験に対応可能末端の C スペーサー付加など非特異な配列の増幅結合を防ぐ修飾 HPLC 精製を行った高品質オリゴ 22

23 1. IDT-illumina Exome Sequencing Solution 2. xgen プローブの特徴. xgen Exome Research Panel. xgen Blocking Oligos 4. xgen Lockdown Reagents (Hybridization and wash kit). マルチプレックス可コスト低減 6. IDT 社のオリゴ合成技術 7. IDT-illumina Exome Sequencing 性能検証データ 2

24 xgen Lockdown Reagents: キャプチャー効率を最大化時間を短縮化ハイブリダイゼーションバッファーと洗浄バッファーのセット xgen 製品を使用した際にキャプチャー効率が最大化するよう調製ハイブリダイゼーション時間は 4 時間 ~16 時間の範囲で 2018 年月 1 日現在の価格です 24

25 1. IDT-illumina Exome Sequencing Solution 2. xgen プローブの特徴. xgen Exome Research Panel. xgen Blocking Oligos 4. xgen Lockdown Reagents (Hybridization and wash kit). マルチプレックス化コスト低減 6. IDT 社のオリゴ合成技術 7. IDT-illumina Exome Sequencing 性能検証データ 2

26 マルチプレックス化コスト低減プレプールしたライブラリでキャプチャー可能キャプチャにおける推奨マルチプレックス数最大 8-plex を推奨より多くのマルチプレックスを実行したいユーザーへは最初に 8-plex で想定通りの十分なデータが得られること確認の上で 12-plex へ拡張することを勧めるより少ないリード数で十分なシーケンス解析可能シーケンス解析にてフローセルあたりより多くの検体の解析が可能 26

27 コスト : Target Enrichment のコスト低減可能 24 sample の解析キャプチャーを 12-plex で行う場合 Library Prep は 24 sample 分必要 Target Enrichment は 2 rxn 分必要 (1 sample あたりの費用は 1/12 rxn 分 ) 1 検体あたり 11,04 円 Description List Price 1-plex 8-plex 12-plex Price/Sample Price/Sample Price/Sample TruSeq DNA Library Prep for Enrichment (24 Samples) 162,000 6,70 6,70 6,70 IDT for Illumina TruSeq DNA UD Indexes (24 Indexes, 96 Samples) 121,000 1,260 1,260 1,260 IDT Lockdown Reagents (16 rxn) 8, IDT Exome Panel (16 rxn) 480,000 0,000,70 2,00 IDT Universal Blockers (16 rxn) 92,00, Total 86,00 44,292 12,46 11,04 Library Prep に用いる illumina 社の Prep kit と Index adapter Target Enrichment に用いる Reagent と Exome Panel と Blocking Oligos とのみで計算した金額である 2018 年月 1 日現在の価格です 27

28 コスト : シーケンス解析でのコスト低減も可能 xgen Exome Research Panel の 12- plex のデータ 4M リード.1 Gb のデータ量で 9.6% 以上の領域で 20X カバレッジ他のパネルでは同様のカバレッジを得るために 2 倍以上のリード必要他のパネルと比べて少ないリード数で十分な解析が可能 1 フローセルあたり倍以上のマルチプレックスでシーケンス解析を行うことができコスト低減が可能 28

29 1. IDT-illumina Exome Sequencing Solution 2. xgen プローブの特徴. xgen Exome Research Panel. xgen Blocking Oligos 4. xgen Lockdown Reagents (Hybridization and wash kit). マルチプレックス化コスト低減 6. IDT 社のオリゴ合成技術 7. IDT-illumina Exome Sequencing 性能検証データ 29

30 Today, IDT is the leading brand in DNA and RNA synthesis 9 locations and >1,000 employees >100,000 active customers >0,000 oligonucleotides & >60 gblocks Fragments and Genes synthesized per day (over million bases per month) >,800 orders per day >400,000 website visits per month >94% of orders from website 0

IDT strategic advantages Vertical integration Quality

(hardware and software) Synthesis inputs are produced and

verified by mass spectrometry Process traceability based on

from R&D to commercialization with GMP and B2B support

31 IDT strategic advantages Vertical integration Quality Flexibility and scalability Support Custom synthesis platform (hardware and software) Synthesis inputs are produced and controlled internally The molecular weight of every oligo is verified by mass spectrometry Process traceability based on custom lab information management system (LIMS) Transition from R&D to commercialization with GMP and B2B support World-class custom formulation and mixing Regionalized customer and technical support 1

Distribution Most reagents are acquired in bulk to reduce lot-to-lot variability

32 Raw materials Superior oligos are made from high quality raw materials Creation of synthesis inputs Production QC Kitting, packaging, and formulation Distribution Most reagents are acquired in bulk to reduce lot-to-lot variability All raw materials undergo QC analysis for impurities known to negatively impact oligo synthesis 2

Raw materials All synthesis inputs used at IDT are

inputs Every synthesis material is QCed before use in

formulation IDT manufactures DNA and RNA

for oligo synthesis IDT produces Nucleoside

33 Raw materials All synthesis inputs used at IDT are created or formulated in-house Creation of synthesis inputs Every synthesis material is QCed before use in production Production QC Kitting, packaging, and formulation IDT manufactures DNA and RNA phosphoramidites, as well as chemical modifications for oligo synthesis IDT produces Nucleoside Controlled Pore Glass (CPG) that is used as a solid support for synthesis Distribution

34 Raw materials Creation of synthesis inputs Production QC Kitting, packaging, and formulation Distribution 4

35 Percent full-length product = (Coupling efficiency) (Total bases 1)

36 IDT oligos have the highest coupling efficiency in the industry Percent full-length product = (Coupling efficiency) (Total bases 1) 6

37 Raw materials Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) is the superior method for confirming the identity of oligonucleotides Creation of synthesis inputs ESI-MS MALDI-TOF MS Production Short oligos (<4bp) Long oligos (>4bp) QC Accuracy Kitting, packaging, and formulation Speed Cost per sample Distribution Low High IDT last used MALDI-TOF Mass Spec in

1 Da Error: 2.24 % Bruker MALDI-TOF Allowed error: 72.

38 MALDI-TOF cannot identify a 120 nt oligo MW = 6,279. Da Voyager MALDI-TOF Allowed error: 72.6 Da Measured error: 84.1 Da Error: 2.24 % Bruker MALDI-TOF Allowed error: 72.6 Da Measured error: N/A Error: N/A ESI Allowed error: 7. Da Measured error: 0. Da Error: % 8

39 Raw materials Creation of synthesis inputs Production QC Kitting, packaging, and formulation Distribution 9

40 xgen Exome Research Panel のプロトコール参考情報 Resources をクリック IDT Exome で検索プロトコールターゲット領域の BED ファイル各プローブの BED ファイルその他参考情報は IDT 社のホームページからダウンロード可能です 40

41 THANK YOU 41

NGS_KAPA RNA HyperPrep Kit

NGS_KAPA RNA HyperPrep Kit シークエンシングワークフローライブラリー調製サンプル調製末端修復エンドポイントライブラリー増幅 A-TAILING アダプターライゲーションサイズセレクション & サイズ確認またはリアルタイムライブラリー増幅ライブラリー定量クラスター増幅 KAPA RNA HyperPrep Kit illumina社用ライブラリー調製キット KAPA RNA HyperPrep Kit