BaseSpaceで達成するSmall RNA発現解析

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1 BaseSpace で達成する Small RNA 発現解析 March 28, 2016 寺倉伸治イルミナ株式会社アプリケーションコンサルタント 2015 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, NextBio, Nextera, NextSeq, Powered by Illumina, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the US and/or other countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

2 Small RNA 解析のワークフロー 1RNA の準備 どれぐらいの RNA が必要か? 抽出に適したキットは何か? 2 ライブラリー調製 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit の留意点 ライブラリーの評価方法 3 シーケンス シーケンス条件について ( 読み量とリード長 ) 最適インストール濃度は? 4 情報解析 BaseSpace でどういった解析が可能か? 出力結果の紹介 2

3 Small RNA 解析のワークフロー 1RNA の準備 どれぐらいの RNA が必要か? 抽出に適したキットは何か? 2 ライブラリー調製 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit の留意点 ライブラリーの評価方法 3 シーケンス シーケンス条件について ( 読み量とリード長 ) 最適インストール濃度は? 4 情報解析 BaseSpace でどういった解析が可能か? 出力結果の紹介 3

4 RNA の準備 RNA の準備 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit を用いたライブラリー調製には 1 μg の Total RNA もしくは 10~ 40 ng Small RNA が必要 RNA の抽出には mirna 用の製品を使用するとよい mirvana ( ライフテクノロジーズ ) mirneasy ( キアゲン ) NucleoSpin mirna ( マッハライナーゲル ) など RIN8 以上を推奨 Agilent Bioanalyzer や Tape Station などを用いて RNA の品質評価を行う mirna 濃縮画分 ( サイズ選別した Small RNA AGO1 免疫沈降物 Exosomal mirna 血漿中 mirna) を用いる場合は Agilent 2100 Bioanalyzer Small RNA チップで mirna の確認するとよい TruSeq Small RNA Sample Prep Kit は 5 末端がモノリン酸化 および 3 末端が OH 基になっている Small RNA を対象としている RNA の性状によっては 酵素処理などが必要かもしれない 4

5 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit の紹介 ライブラリー調製 1Kit あたり 24 反応 1 Kit あたり 12 種類のインデックス付き SetA~D を購入すると最大で 48 インデックスに対応 1.5 日間のワークフロー カタログ番号 キット名 1サンプルあ たりのコスト キット価格 RS TruSeq Small RNA Sample Prep Kit - Set A 19,125 円 459,000 円 RS TruSeq Small RNA Sample Prep Kit - Set B 19,125 円 459,000 円 RS TruSeq Small RNA Sample Prep Kit - Set C 19,125 円 459,000 円 RS TruSeq Small RNA Sample Prep Kit - Set D 19,125 円 459,000 円 価格は試薬消耗品価格表 2016 年 4 月改訂版による 5

6 ライブラリー調製必要準備品 特に注意が必要なもの ライブラリー調製 T4 RNA Ligase 2, Deletion Mutant (Epicentre, Cat# LR2D1132K: 2,000 units [up to 10 libraries], Cat# LR2D11310K: 10,000 units [up to 50 libraries]) SuperScript II Reverse Transcriptase (Life Technologies, Cat# ,000 units [up to 50 libraries]) 電気泳動に必要なもの Novex TBE gels 6%, 10 well (Life Technologies, Cat# EC6265BOX) Novex TBE running buffer (5X) (Invitrogen, Cat# LC6675) 上記の電気泳動が可能な電気泳動槽 (Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis unit など ) Glycogen もしくは同等品 Filter Tube (IST Engineering, Cat# や Costar, Cat#8162 もしくは同等品 ); ゲルからの DNA 抽出の際にゲルデブリを除くのに使用 6

7 ライブラリー調製ワークフロー ライブラリー調製 Total RNA: 1 μg Purified Small RNA Fragments: 10~ 40 ng 3 & 5 Adaptor Ligation 2~ 3 時間 逆転写と PCR 2 時間 ゲルサイズ分画 4 時間 7

8 アダプターライゲーション工程 3 Adaptor Ligation ライブラリー調製 Total RNA (1 μg) RNA 3 Adaptor (RA3) Total Volume 5 ul 1 ul 6 ul 熱変性 70, 2 min. すぐに氷上へ 以下の Premix (4 ul) を加える ( 反応液の総量は 10 μl) Ligation Buffer (HML) RNase Inhibitor T4 RNA Ligase 2, Deletion Mutant Total Volume 28, 60 min. 2 ul 1 ul 1 ul 4 ul 1 ul Stop Solution (STP) を加え ピペッティング ( 反応液の総量は 11 μl) 28, 15 min 氷上へ. 8

9 アダプターライゲーション工程 5 Adaptor Ligation ライブラリー調製 1. PCR チューブに 1 検体あたり 1.1 u*l の RNA 5 Adaptor (RA5) を移し 70 2 分間の処理をしたのち速やかに氷上へ移す * 1 検体であれば 1.1 μl 4 検体であれば 4.4 μl となる 2. 熱変性した RA5 を用いて 以下の 5 adaptor ligation の反応液を調製する Reagent Name 1 rxn 4 rxn 熱変性したRA5 1.1 μl 4.4 μl 10 mm ATP 1.1 μl 4.4 μl T4 RNA Ligase 1.1 μl 4.4 μl Total Volume 3.3 μl 13.2 μl 3. 準備した Premix を用いて 5 adaptor ligation 反応を行う 11 μl 3 Adapter Lifgation 反応物 必要量の 1.1 倍を準備 3 μl の調製した 5 adaptor ligation の反応液を加える ( 反応液の総量は 14 μl) 28, 60 min. 9 ライゲーション産物 (14 μl) 氷上に置き 次のステップへ進む

10 逆転写反応 逆転写反応 6 μl アダプターライゲーション産物 1 μl RNA RT Primerを加える ライブラリー調製 14 ul のライゲーション産物のうち 6 ul を使って逆転写反応を実施余ったライゲーション産物は -80 で 1 週間まで保存可能 熱変性 70, 2 min. すぐに氷上へ 以下の Premix を 5.5 ul 加えます ( 反応液の総量は 12.5 μl) Reagent Name 1 rxn 4 rxn 5X First Strand Buffer* 2 μl 8.8 μl 12.5 mm dntp** 0.5 μl 2.2 μl 100 mm DTT* 1 μl 4.4 μl RNase Inhibitor 1 μl 4.4 μl SuperScript II Reverse Transcriptase* 1 μl 4.4 μl Total Volume 5.5 μl 24.2 μl 50 1 時間反応 氷上へ 複数サンプルの場合は 必要量の 1.1 倍を準備 *5X First Strand Buffer DTT と SuperScript II RTase は invitrogen の SuperScriptII の付属品となります **12.5 mm dntp の準備 25 mm dntp Mix 0.5 μl Ultra Pure Water 0.5 μl Total Volume 1 μl 10

11 PCR Amplification ライブラリー調製 以下の Premix を逆転写産物 (12.5 μl) を加える ( 反応液の総量は 50 μl) Ultra Pure Water PCR Mix(PML) RNA PCR Primer (RP1) RNA PCR Primer Index (RPIX) Total Volume 8.5 μl 25 μl 2 μl 2 μl 37.5 ul RNA PCR Primer は RNA ではありません DNA Primer です RNA PCR Primer Index (RPIX) で Index が付加される PCR 増幅反応 秒間 秒間 秒間 秒間 分間 4 Hold 11 サイクル * *11 サイクルは 1 μg Total RNA を出発材料にした場合です サンプル量や性状に合わせて 最大で 15 サイクルまで増やすことが可能 PCR 産物 (50 μl) は -20 で 1 週間まで保存可能です 11

12 PCR Amplification ライブラリー調製 PCR 産物を Agilent 2100 Bioanalyzer High Sensitivity chip を用いて 評価を行います mirna 分子由来のライブラリーサイズに当たる 150 bp のピークを確認し おおよその濃度を算出 次のゲル切り出しステップで 異なるインデックスを持つライブラリーの mirna ライブラリーの分子濃度をそろえて混合 Human Brain 由来の Total RNA を用いた場合の実施例 12

13 Purify cdna Construct 電気泳動を用いたサイズ選別 ライブラリー調製 1. Agilent Bioanalyzer の評価結果を元に 異なるインデックスを持つライブラリーの mirna 分子の濃度をそろえるように混合します 多検体の場合はプールしたサンプルを切り出した方が手間がかかりませんが 検体数が少ない場合には Agilent Bioanalyzer の評価をスキップして 1 検体づつゲル切り出ししてもよい 2. 電気泳動を行うサンプルとマーカーの準備を行う 電気泳動するもの (3 種類 ) #1 サイズラダー (High Resolution Ladder キットに付属 ) 1 μl High Resolution Ladder + 1 μl DNA Loading Dye= 2 μl (1 レーン分 ) #2 切り出し用の目安マーカー (Custom RNA Ladder キットに付属 ) 2 μl Custom RNA Ladder + 2 ul DNA Loading Dye = 4 ul (2 レーン分 ) #3 PCR 産物 ( ライブラリー ) もしくはプールした PCR 産物 50 μl PCR 産物 + 10 μl DNA loading dye = 60 ul ( レーンあたり 25 μl まで ) 13

14 Purify cdna Construct 電気泳動を用いたサイズ選別 3. 電気泳動の実施 ライブラリー調製 左の泳動図にあるような形で電気泳動を行います E: High Resolution Ladder 2 ul/well, 1 レーン分左の図は 2 レーン流していますが 1 レーンでよい D: Custom RNA Ladder 2 ul/well, 2 レーン分ライブラリーを挟むように流す A: ライブラリー 25 ul/ well, 2 レーン分 Well あたり 30 ul を越えないようにする Novex TBE gels( 6%, 10 well) を用いて 140 V 60 分間の電気泳動を行います 同じ Index を持つ場合には コンタミを避けるために泳動槽を分けます 14

15 Purify cdna Construct 電気泳動を用いたサイズ選別 ライブラリー調製 4. エチジウムブロマイド水溶液 (0.5 μg/ml) で 2~3 分間染色を行います 5. UV トランスイルミネーターで DNA を可視化し切り出しを行います * SYBR Gold での染色と Dark Reader での可視化も OK G: 切り出し目安マーカーが示す 145~ 160 bp が mirna に由来したライブラリー分子となるので ここを切り出す F: Small non coding RNA を対象とする場合はここも切り出す * 130 bp の分子はアダプター同士の連結物になるので 切り出さないように注意! 150bp のバンド 130bp のバンド 5 adaptor mirna (21~25 nt) 3 adaptor Index からっぽ 15

16 ゲルからの DNA 抽出 ライブラリー調製 ゲル破砕用チューブの準備 500 μl tube の底にニードルで穴をあける 穴をあけた 500 μl チューブを 2 ml チューブにセットします ゲルの破砕と DNA の抽出 1. 準備したゲル破砕用チューブに切り出したゲルを入れ 20,000g 2 分間の遠心処理でゲルを 破砕します ul Ultra Pure Waterを破砕したゲルに加え 室温で2 時間以上 Rotatorを用いて混ぜ ます ( 最大でオーバーナイト可 ) 3. フィルター (IST Engineering, part # , ) を用いた遠心処理により ゲルデブリを除く 4. 2 μl Glycogen 30 μl NaOAcと975 μl 冷却したEtOHを加え 20,000g 20 分間の遠心処理 を行います ( エタノール沈殿 ) μl 70% EtOHでリンスを行い 風乾させる μl 10 mm Tris-HCl ph8.5 (EBやRSBでも可) に溶かす ライブラリー完成! User Guide ではエタノール沈殿はオプションの工程だが 実施した方が良い 16

17 ライブラリーの評価 ライブラリー調製 Agilent 2100 Bioanalyzer (DNA1000 チップ ) を用いてサイズと分子濃度の評価を行います mirna に由来したライブラリー分子 (150 bp 程度 ) *Qubit といった二本鎖特異的定量を行い Agilent 2100 Bioanalyzer の評価結果と矛盾しないかを確認するとよい 17

18 ライブラリー調製注意点など ライブラリー調製 RNA の熱変性 (70 2 分間 ) の後は 速やかに氷上へ移す ゲル切りだしには Blue Pippin (sage science) を使うことも可能です ライブラリー不良の原因は スタート RNA に問題があることが多い mirna 専用の抽出キットや 十分量の RNA を準備することが重要です 18

19 Small RNA 解析のワークフロー 1RNA の準備 どれぐらいの RNA が必要か? 抽出に適したキットは何か? 2 ライブラリー調製 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit の留意点 ライブラリーの評価方法 3 シーケンス シーケンス条件について ( 読み量とリード長 ) 最適インストール濃度は? 4 情報解析 BaseSpace でどういった解析が可能か? 出力結果の紹介 19

20 シーケンス条件 検体あたり 100~ 500 万リードの取得が目安 リード長は 50 塩基でよい (mirna 解析の場合 ) シーケンス MiniSeq MiSeq NextSeq 1 ランあたりのサンプル数 (500 万リード取得 ) 1 ~5 ~3 ~5 ~26 ~48 使用試薬 Mid Output High Output V2 V3 Mid Output High Output リード長 1x 50 bp *TruSeq Small RNA Sample Prep Kitは最大で48インデックスまでの対応です カタログ番号 製品名 取得リード数 価格 FC MiniSeq High Output Kit (75 Cycle) 800 万リード 99,000 円 FC MiniSeq High Output Kit (150 Cycle) 2,500 万リード 144,000 円 MS MiSeq Reagent Kit v2 (50 Cycle) 1,500 万リード 144,000 円 MS MiSeq Reagent Kit v3 (150 Cycle) 2,500 万リード 158,000 円 FC NextSeq 500 Mid Output v2 Kit (150 Cycle) 1 億 3,000 万リード 186,000 円 FC NextSeq 500 High Output v2 Kit (150 Cycle) 4 億リード 249,000 円 20 価格は試薬消耗品価格表 2016 年 4 月改訂版による

21 シーケンス注意点 シーケンス Small RNA ライブラリーはサイズが短いため クラスター形成効率がよい クラスターが普段よりも多くできます 経験的な数字ではあるが クラスター形成に用いるライブラリー濃度は通常の 20~30% 程度落としたほうがよい アダプター部分の読み込みや検体の性状により %Base が偏る 標準的なヒト Total RNA から Small RNA ライブラリーを解析した場合 21

22 Small RNA App について 情報解析 Small RNA App でできること mirna の発現解析 DESeq による 二群間解析を実施し 結果を MA プロット PCA プロット ヒートマップ等に描画 mirdeep* を用いた新規 mirna の予測 アダプタートリムはできません 事前に FASTQ Tool Kit 等で実施が必要 Limitation 1 解析に 100 サンプルまで 1 解析に 200 G bases まで 1 サンプルあたり 25 G bases まで 参照配列は ヒト (hg19) マウス (mm10) ラット (rn5) Single Read の FASTQ であること Read Length が 18~51 nt であること 二群間解析なので Replicate での実施が必要になります Software Ver. Isis (Analysis Software): SAMtools: isis Bowtie (Aligner): mirdeep*: 3.2 DESeq2:

23 Small RNA App について解析の実行の前にアダプタートリムの実行 情報解析 FASTQ Toolkit でアダプタートリムの実施リード長をそろえる クオリティトリムなどもできます TruSeq Small RNA をアダプターに選択して実行 MiSeq Reporter Bcl2fastq でもアダプタートリムの実行が可能です 23

24 BaseSpace に FASTQ がアップロードされていない場合は 情報解析 お手持ちの FASTQ を BaseSpace にアップロードする方法 Project の Import アイコンを押すと お手持ちのアップロードできます SRA のデータをアップロードする場合 SRA Import App で Sequence Read Archive のデータをインポートできます Accession 番号 (SRR など ) が必要 24

25 BaseSpace Small RNA App の実行 情報解析 mirdeep* を用いた新規 mirna の発見を行うか? 二群間比較を行うか? 対象生物 (Human Mouse Rat) とデータベース * を選択します *mirbase21 のみ 25

26 BaseSpace Small RNA App の実行 情報解析 グループ名を手入力 サンプルを選択 26

27 BaseSpace Small RNA App の実行 情報解析 Filters は検体を探す出すのに便利 解析を行うサンプルを選択する 27

28 BaseSpace Small RNA App の実行 情報解析 グループとそれに属するサンプルの登録が終わりました *Replicate での登録が必要ですので 検体数は二つ以上選択 28

29 BaseSpace Small RNA App の実行 情報解析 チェックを入れる 二群間解析を行うグループ名を手入力 29

30 BaseSpace Small RNA App の実行 情報解析 Continue を押して 解析スタート! 30

31 BaseSpace Small RNA App の実行 情報解析 MiniSeq で取得したデータ 検体あたり 300~ 500 万リードを 二群間解析 (3 検体と 3 検体との比較 ) を行った場合 45 分 48 秒で終了 31

32 Small RNA v.1.0 App の実行結果 Quality Control Statistics (each Sample) 情報解析 Small RNA Length Distribution Read Distribution Abundamt Distribution 32 mirna Distribution Other RNA Distribution

33 Small RNA v.1.0 App の実行結果 Quality Control Statistics (Aggregate Summary) 情報解析 左メニュの Aggregate Summary を選ぶと全ての検体を並べた結果が表示されます 33

34 Small RNA v.1.0 App の実行結果 Summary and Top Sequences 情報解析 見たいサブセクションを選択します View を押すと その検体での 各 mirna にアライメントされたリード数を確認することが可能です 34

35 Small RNA v.1.0 App の実行結果 Visualization by Precursor 情報解析 mirbase に登録のある mirna を選択する mirbase に登録されている 5 と 3 の mirna に Alignment されたリードのカウント数 5 Counts 3 Counts 35

36 Small RNA v.1.0 App の実行結果 Differential Expression Analysis 情報解析 Aggregate Summary のみの表示 見たいサブセクションを選択します 見たい結果を選択します Pairwise Analysis Sample Correlation PCA Plot Expression Heatmap 36

37 発現解析結果の詳細なファイルについて 情報解析 各サブセクションでの二群間発現解析の結果がまとめられています 左メニュの Output Files を選択 検体ごとのデータ (global) と二群間比較のデータのそれぞれにデータが分けられています 37

38 発現解析結果の詳細なファイルについて 情報解析 deseq.counts.csv 各サンプルの遺伝子ごとのカウント数 ( 補正計算済み ) deseq.res.csv 二群間の比較結果 (Fold Change 補正済み P 値 ) 38 *bam ファイルは出力されますが 各データベース (mirbase など ) に Alignment されているため ( ゲノムに Alignment されていないため ) Genomic Viewer 等での確認はできません

39 Small RNA 解析のワークフロー 1RNA の準備 1 μg の Total RNA が必要 mirna 用の抽出キットを使用するとよい 2 ライブラリー調製 事前試薬の購入 熱変性ステップ 切り出しステップなどで注意が必要 3 シーケンス 1 検体あたり 100~500 万リード リード長は 50 bases クラスター形成に用いる DNA 濃度は普段よりも下げる 4 情報解析 BaseSpace Small App を用いれば 発現解析と新規 mirna の発見が可能 39

40 参考 / データベース イルミナホームページ - Sequencing TS Webinar /4/22 あなたのアプリケーションに適したライブラリー調製キットを探す /4/26 Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit と BaseSpace で完結するバクテリアゲノムアセンブリー /5/13 MiSeq でランをする前に サンプルシート作成ソフト Illumina Experiment Manager (IEM) の使い方 /5/27 TruSeq Rapid Exome & TruSeq Exome Library Prep Kit を用いた Easy Prep Exome User Guide, Q&A, Best Practices - MyIllumina より各種キットサポートページの情報をご確認ください 40

41 ご清聴ありがとうございました 本日セッション終了後のご質問は にお問い合わせください 41