MiSeqのランのセットアップ時・開始時に起こるトラブルの対処方法

Size: px

Start display at page:

Download "MiSeqのランのセットアップ時・開始時に起こるトラブルの対処方法"

あまめてらわ
5 years ago
Views:

1 イルミナソフトウェアを用いた NGS データの解析におけるヒント Dec 4, 2015 渡邊大イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2015 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, NextBio, Nextera, NextSeq, Powered by Illumina, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the US and/or other countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

2 本日の内容 BaseSpaceの使用に関するお問い合わせ - fastq fileがダウンロードできない - fastq fileがアップロードできない - BaseSpace appsが使用できない一般的によくあるお問い合わせ (tophat, cufflinksなど ) VariantStudioに関するお問い合わせ Bcl conversionに関するお問い合わせ - 全ての塩基でNとコールされてしまう - 解析が途中で停止し fastqが生成されない 2

3 本日の内容 BaseSpaceの使用に関するお問い合わせ - fastq fileがダウンロードできない - fastq fileがアップロードできない - BaseSpace appsが使用できない一般的によくあるお問い合わせ (tophat, cufflinksなど ) VariantStudioに関するお問い合わせ Bcl conversionに関するお問い合わせ - 全ての塩基でNとコールされてしまう - 解析が途中で停止し fastqが生成されない 3

4 4 BaseSpace とは

5 5 BaseSpace とは

6 fastq file がダウンロードできない Basespace の便利な機能の一つにランデータをクラウド上に共有し共同研究者の方々にシェアできるというものがあります fastq file は 1:N:0:5[ ヘッダー ] NAAGCATGCATCGCATGCATGCGTACCAGTTANNAAGANNGCTNNNNNANCNAANNNGCATGCATGCANNGTACCCNNNTCCCTCTNCCNCNNACNNAAN[ 配列 ] + #0<FFFFFFFFFFIIIIIIIIIIIBFIIFIFIF##0<BF##00B#####0#0#07###IIIIIIIIII ## 0 0 ### 0 #0 # ##0 ##00 [score] 共同研究者からシーケンス結果をシェアしてもらったが fastqをダウンロードしようとするとが表示されて選択できない 6

7 fastq file がダウンロードできないアクティブにならない Run のシェアだけしていませんか? Project のシェアをしてください 7

8 fastq file がダウンロードできないここからダウンロード可能 8

9 本日の内容 BaseSpaceの使用に関するお問い合わせ - fastq fileがダウンロードできない - fastq fileがアップロードできない - BaseSpace appsが使用できない一般的によくあるお問い合わせ (tophat, cufflinksなど ) VariantStudioに関するお問い合わせ Bcl conversionに関するお問い合わせ - 全ての塩基でNとコールされてしまう - 解析が途中で停止し fastqが生成されない 9

10 fastq file をアップロードできない BaseSpace に fastq ファイルなどをアップロードし BaseSpace apps の input として使う共同研究者の方々と共有するということも可能です Projects タブから新規プロジェクトを作成し fastq をアップロードしようとしても Invalid file などのエラーが出てアップロードが開始されないイルミナファイルの仕様に沿っているかご確認ください 10

11 fastq file をアップロードできない下記のルールに沿っているか確認ください basespace/basespace-user-guide e.pdf またネットワーク環境が悪いことでアップロードができないこともあります BaseSpace cloud の利用の際には 10Mbps 以上のネットワーク環境をご用意ください fastq のアップロードに関する詳細は下記ウェビナーもご参考下さい 2015/09/04 解析に適したリード前処理を行うためにイルミナ株式会社バイオインフォマティクスサポートサイエンティスト癸生川絵里 11

12 本日の内容 BaseSpaceの使用に関するお問い合わせ - fastq fileがダウンロードできない - fastq fileがアップロードできない - BaseSpace appsが使用できない一般的によくあるお問い合わせ (tophat, cufflinksなど ) VariantStudioに関するお問い合わせ Bcl conversionに関するお問い合わせ - 全ての塩基でNとコールされてしまう - 解析が途中で停止し fastqが生成されない 12

13 BaseSpace apps とは 13

14 BaseSpace apps が使用できない Basespace apps を使用しようとしても入力の画面から進めなくなってしまう使用するアプリの limitation をご確認ください 14

15 BaseSpace apps が使用できない Apps の limitation はトップページから確認できる 15

16 本日の内容 BaseSpaceの使用に関するお問い合わせ - fastq fileがダウンロードできない - fastq fileがアップロードできない - BaseSpace appsが使用できない一般的によくあるお問い合わせ (tophat, cufflinksなど ) VariantStudioに関するお問い合わせ Bcl conversionに関するお問い合わせ - 全ての塩基でNとコールされてしまう - 解析が途中で停止し fastqが生成されない 16

17 VariantStudio とは変異解析のためのイルミナソフトウェアリシーケンス apps で生成される vcf ファイルを読み込ませることでコールした変異を解析できる Variants Annotate Filter Report Insight VariantStudio Desktop 17

18 VariantStudio にいくつかの変異が読み込めない VariantStudio に vcf ファイルをインポートしようとするといくつかのファイルフォーマットが読み込めないとエラーがでる XXXXX vcf ファイルをテキストエディタなどで開き記載内容を確認してみてください 18

19 VariantStudio にいくつかの変異が読み込めない本お問い合わせは vcf ファイルを生成するのにイルミナソフトウェア以外を使用している場合またはカスタムの bed ファイルを使用している場合に見られる場合が多くございますイルミナソフトウェアで作成された vcf ファイルは以下の体裁になっていますまずはこの体裁に沿っているかイルミナが使用しない記述などがないかご確認ください (BaseSpace の public data をご参照下さい ) Example) #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT HDC749-Rep1-MixA chr G T 100 PASS DP=13952 GT:GQ:AD 0/1:100:12569 例えば一度に全ての変異を読み込むのではなく確認できる数ずつサブセットを作成して読み込ませることで原因の記述を絞り込むことが可能です 19

20 VariantStudio にいくつかの変異が読み込めないカスタムの bed ファイルをご使用ではありませんか? もしお使いの場合は vcf インポートの際に All variants をご選択頂きエラーなく読み込めるかどうかご確認くださいこれで読み込める場合は vcf ファイルと bed ファイルの記載内容が一致しないことで起こるエラーの可能性がありますご確認くださいここを選ぶ 20

21 BaseSpace HelpCenter のご紹介 BaseSpace をご利用になるうえで HelpCenter の情報も役立つと存じますこれまでにご紹介した内容も含め詳細にご案内しておりますをご参照下さい 21

22 BaseSpace blog のご紹介 BaseSpace をご利用になるうえでこまめに up-to-date な情報を得たい方は BaseSpace blog がお勧めですをご参照下さい 22

23 本日の内容 BaseSpaceの使用に関するお問い合わせ - fastq fileがダウンロードできない - fastq fileがアップロードできない - BaseSpace appsが使用できない一般的によくあるお問い合わせ (tophat, cufflinksなど ) VariantStudioに関するお問い合わせ Bcl conversionに関するお問い合わせ - 全ての塩基でNとコールされてしまう - 解析が途中で停止し fastqが生成されない 23

24 bcl conversion とは Analysis Type Software Outputs Sequencing ICS/RTA Images/TIFF files Primary Analysis ICS/RTA Intensities Base Calling bclファイル Secondary Analysis HiSeq Analysis Software Alignments and Variant Detection 24

25 fastq が全て N と表記されてしまうシーケンスの結果リードのクオリティが悪い画像処理の結果特定の塩基をコールできない場合などは N と標記される [I] C Called base C I A I A I B CHASTITY formula [nm] A C G T シーケンス結果は悪くなく何らかの塩基をコールしているようにみえるのに結果は全て N になってしまう 25

26 fastq が全て N と表記されてしまう 26

27 fastq が全て N と表記されてしまうアダプタートリムの設定で短いリードを読もうとしていませんか? 27

28 fastq が全て N と表記されてしまう Raw read trimmed read bp Adapter sequence アダプタートリムの機能は水色の部分を取り除く bp NNNNNNNNNNNNNNN トリム後 35bp を下回る場合には N でリードを補う trimmed read bp NNNNNNNNNNNNNNN 結果 AGCT でコールされた塩基数が 22 を下回る場合にはリード全てが N でマスクされてしまう All N read NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN アダプタートリムの設定を見直すかオプションの設定数値を指定しなおして下さい 28

29 本日の内容 BasesSpaceの使用に関するお問い合わせ - fastq fileがダウンロードできない - fastq fileがアップロードできない - BaseSpace appsが使用できない一般的によくあるお問い合わせ (tophat, cufflinksなど ) VariantStudioに関するお問い合わせ Bcl conversionに関するお問い合わせ - 全ての塩基でNとコールされてしまう - 解析が途中で停止し fastqが生成されない 29

30 bcl conversion が途中で abort してしまう bcl conversion を行ったが conversion プロセスが途中で中断してしまう以下のようなメッセージが nohup.out などのログに残る Examples) - Failed to read number of clusters from /s_1_1101.bcl.gz - Failed to read BCL file /s_4_1103.bcl.gz - Error: 2015-Jul-09 08:46:18: Invalid argument: /usr/ /BclReader.cpp(115) : Throw in function unsigned int casava::alignment::bclreader::readclustercount() 途中でラン停止などのいつもと異なることがありませんでしたか? シーケンサーとサーバー間の接続は中断されたりしませんでしたか? 以上の情報を添えてテクニカルサポートまでご一報ください 30

31 bcl conversion が途中で abort してしまう状況を精査させていただき対応させていただきたく存じますまずは下記のコマンドをランデータのルートディレクトリで走らせて頂きファイル構造をテキスト化していただけませんでしょうか $ find xargs ls -l gzip -c > directory.structure.txt.gz このファイルが生成されたらテクニカルサポートにお知らせくださいこちらの情報を元に各サイクルごとの bcl ファイルの生成状況を精査いたします恐れ入りますが状況によっては fastq ファイルの救出ができないこともございますがシーケンスの状況を鑑みエラーの原因と今後についてご案内させていただければ幸いです 31

32 参考資料イルミナサポートウェビナー [ 日本語での BaseSpace についての情報が充実しています ] BaseSpace 関連 ace-user-guide e.pdf [BaseSpace の基本的な使い方はこちらに記載してあります ] ml [ 少し応用的ですが BaseSpace apps の使用に際してはこちらが有用です ] MiSeq Reporter や bcl2fastq など各種ソフトウェア [ こちらのページから全てのソフトウェアのユーザーガイドが入手できます ] 32

2015 年 5 月 15 日イルミナサポートウェビナー Nextera Rapid Capture Exome キットを用いたエクソームシーケンス - ドライ編 BaseSpace で行うかんたん NGS データ解析 < Enrichment アプリ > イルミナ株式会社バイオインフォマティクスサ

2015 年 5 月 15 日イルミナサポートウェビナー Nextera Rapid Capture Exome キットを用いたエクソームシーケンス - ドライ編 BaseSpace で行うかんたん NGS データ解析 < アプリ > イルミナ株式会社バイオインフォマティクスサポートサイエンティスト癸生川絵里 (Eri Kibukawa) 2014 Illumina, Inc. All rights

MiSeqのランのセットアップ時・開始時 に起こるトラブルの対処方法

MiSeqのランのセットアップ時・開始時に起こるトラブルの対処方法