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1 Bioanalyzer と qpcr を使用したライブラリの定性 定量評価 酒井名朋子イルミナ株式会社テクニカルサポート 2010 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, Solexa, Making Sense Out of Life, Oligator, Sentrix, GoldenGate, GoldenGate Indexing, DASL, BeadArray, Array of Arrays, Infinium, BeadXpress, VeraCode, IntelliHyb, iselect, CSPro, GenomeStudio, Genetic Energy, HiSeq, and HiScan are registered trademarks or trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 Library の定性 定量評価 ライブラリ調製後の手順 定性評価 定量評価 ゲル泳動 qpcr Agilent Bioanalyzer 2

3 Library QC の手段 : Gel visualization Library の 10% を 2%Agarose gel にロードする 確認項目 : Library サイズが予想通りかどうか Adapter Ligation 後の想定 DNA サイズと同程度かどうか 126bp に強いバンドが存在しないか ( アダプターダイマー ) 存在する場合は Gel Purification のステップを繰り返す 500bp 400bp 3

4 Library QC の手段 : Agilent 2100 Bioanalyzer ターゲットサイズ 量によりチップを使い分け Bioanalyzer トレースはサイズ分布を知る目的で利用 定量結果は不確か トラブルシューティングの際に必要 4 Image from

5 5 Agilent Bioanalyzer 2100: 概要

6 Agilent Bioanalyzer Workflow 手順 ゲルと Dye を混ぜる * チップを準備する サンプルとラダーをチップに乗せる チップを Voltex する Bioanalyzer にチップをセットし泳動を開始する Data 評価 *if first time using kit 6

7 Bioanalyzer 用チップの準備 ゲルと Dye を混ぜる * チップを準備する 1. ゲルと Dye を混ぜ 30 分室温に置く 2. チップを用意し Chip Priming Station に置く 3. 9uL のゲル Dye 混合液を該当 Well におく 泡が入らないように注意すること 4. 付属シリンジで圧をかけ, ゲルをチップに注入する シリンジを押し込み 60 秒間ホールドする留め具をつける プランジャーをリリースし 5 秒間待つ Chip Priming Station から外す 5. 次のスロットにゲル Dye 混合物をロードする. 9uL gel-dye mix 9uL gel-dye mix 7

8 Loading Agilent chips ゲルと Dye を混ぜる * チップを準備する サンプルとラダーをチップに乗せる 6. 5uL のマーカーをすべての Well に注入する 7. 該当箇所に DNA ラダーを入れる 8. 必要のある場合は Library を希釈する 9. 1uL のサンプルと DNA マーカーをロードする 1uL sample or DNA ladder per well 1uL DNA ladder チップを Voltex する Bioanalyzer にチップをセットし泳動を開始する 8

9 Bioanalyzer トレースを理解する Data 評価 理想的な Bioanalyzer 結果とは : サンプル由来のピークが二つのマーカー (35bp と 10Kbp) のピークの間に存在する ベースラインが安定して低い マーカーの Intensity がベースラインより十分大きい マーカーのピークがサンプルピークと被っていないこと Lower Marker Sample Peaks Upper Marker 9

10 Bioanalyzer レポートを理解する チェック項目 ピークは 1 本か Adapter Dimer ビーズの持越しがないか 10

11 TruSeq DNA library の理想的な Bioanalyzer トレース Gel Gel-free 11

12 Bioanalyzer の定量結果が正確でない理由 サンプルをオーバーロードすると定量結果が不正確 1:5 希釈の場合 16ng/uL と表示 1:20 希釈の場合 36ng/ul と表示 定量には Qubit や qpcr をご使用ください 12

13 Library QC: Summary Gel Images ゲル電気泳動結果 Library が期待したサイズであること Adapter dimer が存在しないこと Agilent BioAnalyzer 2100 Library が期待したサイズであること Adapter dimer が存在しないことピークが 1 本であること ビーズの持越し PCR での Overamplification 由来の産物 13

14 14 qpcr を使用した Library の定量

15 最適クラスター数はデータ量を増やす Optimized flow cell clustering determines data quality and overall data yield 20pM 10pM 5pM 1pM Over cluster になってしまうと Quality と Yield が下がる Focus が合わなくなる Run の失敗 Cluster 数が少ないと Data 量が少ない サンプルが無駄になる Focus が合わなくなる Run の失敗 15

16 Cluster Density 最適クラスター数 Sequencing Platform Raw Cluster Density in Kcluster/mm 2 GAII and GAIIx 700,000 to 800,000 HiSeq v3 750,000 to 850,000 MiSeq v1 750,000 to 850,000 MiSeq v2 ~1500, pm Clusters 線形 (Clusters) 16

17 Multiplex でサンプルを Pool する際には特に注意! Sample ライブラリの一つが 10 倍高く濃度が見積もられていた場合 Expected Output Actual Output 1 16% 20% 2 16% 20% 3 16% 20% 4 16% 20% 5 16% 20% 6 16% 2% Sample Expected Output ライブライの一つが 10 倍低く見積もられていた場合 Actual Output 1 16% 66% 2 16% 6% 3 16% 6% 4 16% 6% 5 16% 6% 6 16% 6% 17

18 >=Q30 (%) Flow Cell の Titration Flow Cell Titration どの程度の Library 濃度でどの程度のクラスター数が出るか FC の 3-4 レーンを 使用 Library によってはデータを使用可能 pM 10pM 5pM 1pM Cluster Density 85 20pM 10pM 5pM 1pM Q30 Score 18

19 Flow Cell Titration における注意事項 使用するqPCR 装置 Sequence 装置 試薬のバージョンは一定にする Titration 結果に影響を及ぼすParameter Sequencer(GA HiSeq MiSeq) クラスター形成装置 (Cluster Station cbot MiSeq) Denatureの方法 Library 長とGC 含量 19

20 Library の定量方法 UV- 吸光 Nanodrop 核酸以外の物質も検出 Contaminants が値を左右する Sample prep の Input や validation には使用不可 Bioanalyzer 2100 希釈とサンプルの Handling により Accuracy が変わる Quality のチェックにのみ使用 蛍光ベースの ds-dna assay Qubit or PicoGreen ds DNA を特定的に検出 不完全な Library も検出 qpcr 完全な Library のみを検出 検出限界が低い 20

21 qpcr の原理 1. Sybr Green が PCR Mix に含まれる 2. PCR Primer がアニーリングし 3. 伸長反応が起こると Sybr Green が取り込まれる 4. 取り込まれた Sybr Green が発光する 5. 蛍光を検出 6. その後のサイクルでは 1-4 を繰り返す 21

22 qpcr Amplification Curve 検量線 Threshold Cq :Threshold に達した際のサイクル数 立ち上がりサイクル quantifictaion cycle 22

23 qpcr Overview qpcr ではクラスター形成可能な Lirary のみを検出 FC 上のオリゴ P5 と P7 配列の一部に該当する PCR Primer を使用 Adapter が両端についた Library のみを検出 23

24 qpcr での定量の準備 Step 1 検量線用の DNA を準備 Step 2 検量線用 DNA の希釈 Step 3 Library の希釈 Step 4 qpcr 試薬の準備 装置の運転 Step 5 qpcr データの解析 24

25 1. 検量線用の DNA を準備 検量線にふさわしい DNA P5 P7 配列を両端に持ったIlluminaシーケンサー用 Library サンプルと同様の長さ GC 含量のもの サンプルと同様の種類のLibrary(gDNA, RNA, small RNA) 分注して保存されているもの 2-20pMの範囲でCluster 数が適正に検出されるもの qpcr 用キット KAPA Library Quantification Kit KK

26 2. 検量線用 DNA の希釈 2nM 程度の Library 原液から調製 20pM まで 100 倍希釈 (0.1% Tween 20 もしくは MilliQ 水 ) 2 倍希釈を 0.1% Tween 20 で行う しっかり Voltex したのち分注する pM 10pM 5pM 2.5pM 1.25pM 0.625pM pM Final Concentrations 26

27 3. サンプルの希釈 サンプルの希釈 Bioanalzyerトレースより大まかな濃度の予想 ~2nM のQiagen EB Bufferに保持したサンプルより開始 500 倍希釈し ~ 4pM 程度に調製する 2 倍希釈をTriplicate になるように調製する しっかりVoltexしたのち分注する 2µL unknown + 998µL 0.1% Tween 20 2nM 4pM 27

28 4.qPCR Run の開始 PCRMix はキットに沿って調製 Primer は 10uM になるように調製する Thermal cycling conditions の例 28

29 4.qPCR Run のレイアウト ( 例 ) 検量線 7 点 2-fold dilution factor サンプル 8 samples Technical triplicates Negative control 1 点 Unknown Standard Non-Template Control SBS Library Quantification Template 29

30 5. 結果の評価 検量線の評価 : Efficiency( 増幅効率 ) は +/- 10% from 100% Efficiency= 10^(-1/Slop) Slope :-3.60 to 検量線の傾き R 2 > 0.99 Outlier をはずす (replicate で Cq の違いが 0.5 以上あるもの ) サンプルが検量線の中に入っているかどうか Outlier をはずす (replicate で Cq の違いが 0.5 以上あるもの ) Slope R Efficiency % 30

31 5. 結果の評価 検量線の濃度計算 DNA 定量値 (ng/ul) より DNA の平均分子量 検量線サンプルの長さより濃度 (nm) を計算 希釈倍率を考慮に入れる Bioanalyzer Qubit と比較して qpcr の定量結果と大幅にずれる場合 一つの方法からの結果を採用する qpcr が最も正確 定量されたサンプルを希釈し Cluster Generation 進んでください 31

32 32 ご清聴ありがとうございました