予算申請ウェビナーウイルス、微生物編

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としなりいさやま
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1 予算申請ウェビナーウイルス微生物編イルミナ株式会社マーケティング本部プロダクトマーケティング部 2016 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, MiniSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, NextBio, Nextera, NextSeq, Powered by Illumina, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the US and/or other countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

2 本日の内容次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成ウイルス微生物アプリケーションの紹介微生物全ゲノム解析ウイルスゲノム解析メタゲノム解析最適な NGS システムの選び方 2

3 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成 3

4 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成研究目的研究方法など研究の学術的背景研究課題の核心をなす学術的問い研究の目的および学術的独自性と創造性研究で何をどのようにどこまで明らかにしようとするのか研究経費とその必要性設備備品の明細消耗品費の明細設備備品消耗品費の必要性 4

5 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成研究目的研究方法など研究の目的 : 疾患と関係する微生物の同定とメカニズムの理解どのように : メタゲノム解析による微生物のスクリーニング後特定した原因菌の全ゲノム解析どこまで : 疾患を引き起こす遺伝子の特定研究経費とその必要性設備備品 : 次世代シーケンサー ( 既存新規 ) 消耗品費 : シーケンス試薬ライブラリー調製キット研究計画調書作成に必要な情報をご提供 5

6 ウイルス微生物研究における NGS の活用例生物学公衆衛生医学農学環境有用微生物の同定機能遺伝子解析原因菌の同定感染経路の特定健康治療との関連性メカニズムの解明環境調査モニタリング全ゲノム解析メタゲノム解析 6

7 NGS が活用されているアプリケーション微生物ゲノム解析ウイルスゲノム解析メタゲノム解析特定の微生物ウイルスの解析微生物群集の解析全ゲノムの配列情報遺伝子機能解析微生物群の種類の同定存在比率の推定分子系統樹の作成感染経路の特定病原性遺伝子の同定特定微生物菌種の同定環境と微生物叢の関係性の解明バイオマーカーの発見 7

8 微生物向けアプリケーションに求められる条件微生物ゲノム解析ウイルスゲノム解析メタゲノム解析ゲノムサイズ数 Mb 数 Kb - 単離培養必要必要 / 不要不要リード長 300bp 以上 300bp 以上 500bp 以上データ量ゲノムサイズの 30~100 倍ゲノムサイズの 100 倍以上 10 万リードアプリケーションに最適な装置試薬を選択 8

9 イルミナ NGS を利用した微生物研究ワークフローサンプルライブラリー作製シーケンスデータ解析 Or ゲノム DNA Or トータル RNA ライブラリー調製キットシーケンサー最適なワークフローと機器消耗品をご紹介 9

10 本日の内容次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成ウイルス微生物アプリケーションの紹介微生物全ゲノム解析ウイルスゲノム解析メタゲノム解析最適な NGS システムの選び方 10

11 微生物全ゲノム解析 11

12 微生物に存在する特定の遺伝子を同定するには全ゲノム解析から始めるのが近道ドラフトゲノム解析複数株に対して NGS を用いて網羅的に全ゲノム解析を実施分子系統樹解析株同士のゲノム配列を比較して特異的な配列遺伝子を同定同定遺伝子をサブタイピング同定した遺伝子に対するプライマー配列を設計しサブタイピングを実施 12

13 採択研究事例 1. MiSeq と Nextera XT を用いたドラフトゲノム配列の取得 2. 全ゲノム高解像度系統樹解析 3. Stx2 ファージサブタイピング 4. Stx2 産生量の定量科学研究費助成事業データベース : 九州大学大学院医学研究院細菌学分野小椋義俊先生 13

14 解析目的に合わせて全ゲノム解析手法を選択既知微生物種の変異解析リシーケンス法リードを参照ゲノム配列にアライメントするサンプルあたり 30x 以上を推奨参照ゲノム配列 Repeat Repeat 新規微生物種解読既知微生物種に導入された遺伝子の探索 de novo アセンブリ法リード同士の配列を繋ぎ合わせるサンプルあたり 100x 以上を推奨コンティグ配列 14 メイトペアライブラリー

15 ライブラリー調製キットのワークフローの比較リシーケンス法 Nextera XT ライブラリー調製キット de novo アセンブリ法 Nextera Mate Pair ライブラリー調製キット 15

16 微生物全ゲノム解析のワークフローとコスト 3Mb の生物種を想定した場合ライブラリー作製シーケンスデータ解析消耗品費リシーケンスサンプルあたりのデータ量 90Mb 以上 (30x) Nextera XT DNA Sample Prep Kit 1 サンプル 6,000 MiSeq Reagent Kit v2 (300 Cycle) 1 サンプル 3,938 MiSeq Reporter Resequencing ( 変異検出 ) 無償 MiSeq 1 ラン (48 サンプル ) 1 サンプル合計 9,938* de novo アセンブリサンプルあたりのデータ量 300Mb 以上 (100x) Nextera Mate-Pair Sample Prep 1 サンプル 15,625 MiSeq Reagent Kit v2 (300 Cycle) 1 サンプル 15,750 BaseSpace アプリ Velvet de novo Assembly(10 icredit) 1 サンプル 133 MiSeq 1 ラン (12 サンプル ) 1 サンプル合計 31, 価格は 2017 年 6 月現在の価格です

17 Prokka Genome Annotation でアノテーション 17

18 微生物全ゲノム解析に必要な消耗品カタログ番号製品名希望販売価格リシーケンスライブラリー調製キット FC Nextera XT DNA Sample Prep Kit(96 Samples) 546,000 FC Nextera XT Index Kit v2 Set A(96 Indices, 384 Samples) 179,000 シーケンス試薬キット MS MiSeq Reagent Kit v2(300 Cycles) 189,000 FC MiniSeq Mid Output Kit(300 Cycles) 99,000 カタログ番号製品名希望販売価格 de novoアセンブリライブラリー調製キット FC Nextera Mate Pair Sample Prep Kit(48 Samples) 750,000 シーケンス試薬キット MS MiSeq Reagent Kit v2(300 Cycles) 189,000 FC MiniSeq Mid Output Kit(300 Cycles) 99,000 18

19 微生物全ゲノム解析のまとめ微生物の機能解析の方法複数株に対してNGSを用いた全ゲノム解析を実施複数株を用いて分子系統樹解析を実施特異的な遺伝子または配列を同定全ゲノム解析の方法は 2 種類既知微生物種の変異解析にはリシーケンス法新規微生物種解読既知微生物種に導入された遺伝子の探索には de novo アセンブリ法 19

20 ウイルスゲノム解析 20

21 単離培養の可否に応じて 2 つの解析手法を選択単離培養が可能な場合インフルエンザウイルスなど単離培養が困難な場合臨床サンプルノロウイルスなど解析方法単離培養したウイルスから RNA を抽出して逆転写した cdna を用いてゲノム解析を実施解析方法臨床サンプルから Total RNA 抽出した後ホストおよび細菌の rrna を除去した残りの RNA をシーケンス RNA ウイルス配列だけを抽出して解析 21

22 採択研究事例 1. 胃腸炎事例について NGS を用いたメタゲノム解析を実施 2. 公定法では陰性だった検体からノロウイルスを検出 3. 牡蠣からは複数のノロウイルス遺伝子型と他のウイルスを検出 22 科学研究費助成事業データベース : 富山県衛生研究所滝沢剛則先生

23 臨床サンプルからの効率的に RNA ウイルスをシーケンスするためのコツ Total RNA 中の 80% 以上を占めるホストおよび細菌の rrna をシーケンス前に除去することが重要 Ribo-Zero Gold Epidemiology Kit ホストおよび細菌の rrna を除去 ScriptSeq v2 RNA-Seq でライブラリー調製 23

24 RNA ウイルス解析のワークフローとコストライブラリー作製シーケンスデータ解析消耗品費用単離培養が困難な場合ウイルスとホストの両方の RNA をシーケンス (500 万リード ) ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology)+ ScriptSeq Index PCR 1 サンプル 24,349 MiSeq Reagent Kit v3 (150 Cycle) 1 サンプル 27,000 BaseSpace アプリ Kraken での解析 (4 icredit) 1 サンプル約 640 MiSeq 1 ラン (6 サンプル ) 1 サンプル合計 51,349 単離培養が可能な場合 cdna に逆転写後 Nextera XT DNA Sample Prep Kit+ Nextera XT Index Kit 1 サンプル 6,467 ウイルス由来の核酸のみを抽出してシーケンス (100x) MiSeq Reagent Micro Kit v2 (300 Cycle) 1 サンプル 825 MiSeq Reporter Resequencing ( 変異検出 ) 無償 MiSeq 1 ラン (96 サンプル ) 1 サンプル合計 7, 価格は 2017 年 6 月現在の価格です

25 単離培養が可能なウイルス種のゲノム解析は低スループットキットでも複数サンプル解析可能ゲノムサイズリシーケンスの推奨データ量装置試薬キット ( データ量 ) サンプル数シーケンス単価 MiSeq V2 Nano (300Mb) 24 2,175 円 10Kb 100x V2 Micro (1.2Gb) 円 MiniSeq Mid Output (2.4Gb) 円 25

26 ウイルスゲノム解析に必要な消耗品カタログ番号製品名希望販売価格単離培養が可能な場合ライブラリー調製キット FC Nextera XT DNA Sample Prep Kit(24 Samples) 144,000 FC Nextera XT Index Kit v2 Set A(96 Indices, 384 Samples) 179,000 シーケンス試薬キット MS MiSeq Reagent Micro Kit v2(300 Cycles) 79,200 MS MiSeq Reagent Nano Kit v2(300 Cycles) 52,200 FC MiniSeq Mid Output Kit(300 Cycles) 99,000 単離培養が困難な場合ライブラリー調製キット MRZE706 Ribo-Zero Gold Epidemiology Kit(6 Reactions) 105,000 RSBC10948 ScriptSeq Index PCR Primers(Set 1)(48 Reactions) 42,700 シーケンス試薬キット MS MiSeq Reagent Kit v3(150 Cycles) 162,000 FC MiniSeq High Output Kit(150 Cycles) 174,000 26

27 ウイルスゲノム解析まとめ次世代シーケンサー利用のメリット既存法では不検出とされたサンプルからもウイルスが検出可能サンプル内に複数の遺伝子型を持つウイルスの同定も可能ウイルスゲノム解析手法は 2 種類単離培養の可否により解析手法が異なる RNA ウイルス解析に最適なシステム比較的短いリード長で実施可能なため MiniSeq でも十分に解析可能単離培養が可能なウイルス種を解析する場合は MiSeq の低スループット試薬キットの利用でトータルコストを抑えることが可能 27

28 メタゲノム解析 28

29 メタゲノム解析の用途ヒトマイクロバイオーム人の体内および表面に存在する微生物群の研究人の健康および罹患状態における微生物の役割の理解環境メタゲノミクス環境サンプルに存在する微生物群の研究農学的生態学的改善または生物学的調査 29

ヒトマイクロバイオーム研究例肥満菌叢の多様性が低い傾向 Chatelier E. et al, Nature (2013) マーカー遺伝子の同定糖尿病 Junjie Qin et al, Nature (2012) マーカー菌種の同定 Zeller G et al, Mol Syst Biol. (2014) 大腸癌 Zackular J et al. Can Prev Res.

30 ヒトマイクロバイオーム研究例肥満菌叢の多様性が低い傾向 Chatelier E. et al, Nature (2013) マーカー遺伝子の同定糖尿病 Junjie Qin et al, Nature (2012) マーカー菌種の同定 Zeller G et al, Mol Syst Biol. (2014) 大腸癌 Zackular J et al. Can Prev Res. (2014) 肝癌肝癌誘発菌種の同定 Yoshimoto et al. Nature (2013) 人工甘味料による耐糖能異常食生活 Suez J. et al., Nature. (2014) 近年では腸内細菌叢と免疫との関係を調べる研究テーマの採択が多い Aymé Spor, Omry Koren & Ruth Ley, Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nature Reviews Microbiology 30 9, (April 2011)

31 メタゲノム解析で用いられる 2 つの手法 16s rrna 解析ショットガン解析 16s rrna 遺伝子はウィルスを除くすべての微生物に存在 16s rrna 遺伝子のみをシーケンス 16s rrna の配列は多様性を持つため配列情報からサンプルに含まれる微生物の同定が可能サンプル中に含まれるゲノムおよび転写物をシーケンス微量にしか含まれない微生物ウイルスの同定が可能種の同定だけでなく遺伝子解析も可能 31

32 解析目的に応じて 2 つの解析手法を選択 16s rrna 解析が有用なケース微生物の菌種および存在の検出ショットガン解析が有用なケース微生物およびウイルスの両方を検出微量にしか存在しない微生物の検出微生物の機能性 / 病原性遺伝子の検出および機能予測 32

33 メタゲノム解析のワークフローとコストライブラリー作製シーケンスデータ解析消耗品費用 16S rrna 解析サンプルあたり 10 万リード Nextera Index Kit 1 サンプル 474* MiSeq Reagent Kit v3 (600 Cycle) 1 サンプル 2,875 BaseSpace アプリ 16S Metagenomics (1 icredit) 1 サンプル約 50 MiSeq 1 ラン (96 サンプル ) 1 サンプル合計 3,349 ショットガン解析サンプルあたり 1,000 万リード Nextera XT DNA Sample Prep Kit 1 サンプル 6,000 MiSeq Reagent Kit v3 (150 Cycle) 1 サンプル 81,000 BaseSpace アプリ Kraken (2 icredit) 1 サンプル約 320 MiSeq 1 ラン (2 サンプル ) 1 サンプル合計 87, *Nextera Index Kit のみ PCR プライマー分を含まず価格は 2017 年 6 月現在の価格です

34 16S rrna 解析では 300pbx2 を推奨 341F V3-V4 領域シーケンス 805R 300 bp PE でオーバーラップ 341F 805R 150 bp PE では V3 領域しか読めない V4 領域シーケンス 515F 806R 150 bp PE でオーバーラップ 34

35 BaseSpace 16S Metagenomics Appなら複数サンプルの比較解析も簡単タクソノミー階層ごとの分類 16S Metagenomics App 微生物多様性指標イルミナ開発サポートしている解析アプリ主座標解析 (PCoA) 系統樹解析 35

36 ショットガン解析では 1000 万リード以上を推奨 NextSeq なら低コストで実施可能リード数装置試薬キット ( リード数 ) サンプル数シーケンスコスト MiniSeq High Output (2,500 万 ) 2 87,000 円 1,000 万 MiSeq NextSeq V3 (2,500 万 ) Mid Output (1.3 億 ) High Output (4 億 ) 2 81,000 円 10 19,100 円 30 16,700 円 36

37 メタゲノム解析に必要な消耗品カタログ番号製品名希望販売価格 16S rrna メタゲノム解析ライブラリー調製キット FC Nextera XT Index Kit v2 Set A(96 Indices, 384 Samples) 179,000 シーケンス試薬キット MS MiSeq Reagent Kit v3(600 Cycles) 276,000 ショットガンメタゲノム解析ライブラリー調製キット FC Nextera XT DNA Sample Prep Kit(96 Samples) 546,000 FC Nextera XT Index Kit v2 Set A(96 Indices, 384 Samples) 179,000 シーケンス試薬キット FC MiniSeq High Output Kit(300 Cycles) 279,000 MS MiSeq Reagent Kit v3(150 Cycles) 162,000 FC NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2(150 Cycles) 191,000 37

38 メタゲノム解析まとめメタゲノム解析の用途は 2 種類ヒトの健康や疾患と微生物との関係を研究するヒトマイクロバイオーム土壌や河川などに生息する微生物群を研究する環境メタゲノミクス研究トレンド免疫疾患と腸内細菌叢との関連を調べるヒトマイクロバイオーム研究課題の採択が増加メタゲノム解析のアプローチは 2 種類 16s rrna 解析とショットガン解析メタゲノム解析に最適なシステム V3-V4 領域をターゲットとする 16S rrna 解析の場合は MiSeq が必須多数のリード数が必要なショットガン解析の場合は NextSeq が有利 38

39 本日の内容次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成ウイルス微生物アプリケーションの紹介微生物全ゲノム解析ウイルスゲノム解析メタゲノム解析最適な NGS システムの選び方 39

40 NGS システムの選び方 40

41 微生物ウイルスゲノムはゲノムサイズが小さいためベンチトップシーケンサーが最適イルミナベンチトップシーケンサーのスループット比較表 MiniSeq MiSeq NextSeq 550 最大データ量 7.5 Gb 15 Gb 120 Gb 最大リード長 150bp x 2 300bp x 2 150bp x 2 最大クラスター数 2,500 万 2,500 万 4 億 Gbあたりのコスト 37,200 円 18,400 円 6,675 円本体価格 824 万円 1,650 万円 4,580 万円 41

42 微生物ウイルスゲノム解析に必要な設備費用カタログ番号製品名希望販売価格 MiniSeqシステム SY MiniSeq システム 1 年保証付 8,240, Illumina Product Care MiniSeq Basic Plan 800,000 MiSeqシステム SY MiSeq システム 1 年保証付 16,500,000 SV Illumina Product Care MiSeq Basic Plan 2,260,000 NextSeqシステム SY NextSeq 550 システム 1 年保証付 45,800,000 SV Illumina Product Care NextSeq 550 Basic Plan 4,410,000 42

43 データ解析は初期コスト不要のクラウドサービス BaseSpace Sequence Hub サービス一覧ライセンス費用ベーシックプロフェッショナルエンタープライズ無償無償お問い合わせ標準ストレージ 1TB まで 1TB まで 1TB まで追加ストレージ ( 有償 ) 不可可可初期付与ポイント 250 icredit *1 250 icredit *2 250 icredit *2 無償アプリ利用可可可有償アプリ利用不可可 *3 可 *3 グループ利用プロフェッショナルサービスサポートプライベートドメインシングルサインオン *4 43 *1. アカウント作成後 30 日間の期間限定でトライアルポイントが付与されます *2. ライセンスご購入初年度のみ付与されます *3. アプリ利用にかかった時間に応じて毎月毎にご請求いたします *4. 固定価格プランのプロフェッショナルアカウントが対象です

44 まとめ 44 微生物研究の目的目標に応じて適切な研究計画の策定生物種サンプル数 NGS のアプリケーション代表的な NGS アプリケーション微生物ウイルスの全ゲノム解析メタゲノム解析微生物ウイルス研究に最適なシステムゲノムサイズが小さいのでベンチトップ型がお勧め長いリードを必要とするアプリケーションが多数存在するため MiSeq を中心に装置を選択最適なデータ解析環境は BaseSpace Sequence Hub 微生物解析用のアプリを多数搭載利用料は解析した分だけお支払

45 ご静聴ありがとうございました製品のお見積に関するお問い合せ先イルミナ株式会社営業本部 45

Microsoft PowerPoint - 社外資料_TruSeq Synthetic Long-Read DNA Library Prep.pptx

Microsoft PowerPoint - 社外資料_TruSeq Synthetic Long-Read DNA Library Prep.pptx TruSeq Synthetic Long- Read DNA ライブラリー調製キットイルミナ株式会社マーケティング部 2014 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, IlluminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadArray, BlueFish, BeadXpress, BlueFuse, cbot,

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