第2回複数の誤差を持つ実験データ

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ゆきのじま
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1 複数の誤差を持つ実験データ第 2 回高橋セミナー 2 年 1 月 29 日総評会館日本ロシュ高橋行雄

2 目次第 1 章複数の誤差 1 第 1 節はじめに... 1 第 2 節統計ソフト... 1 第 3 節今回のテーマ... 2 第 2 章逐次増量実験 3 第 1 節逐次増量の例... 3 第 2 節誤差の構造... 5 第 3 節 MIXEDプロシジャによる解... 5 第 4 節 JMPによる実習... 9 第 3 章アトロピンの逐次増量 13 第 1 節適切でない実験データの解析第 2 節ウサギの流延抑制第 3 節 JMPによるデータのグラフ化第 4 章摘出回腸の収縮 23 第 1 節マグヌス装置による実験第 2 節実験データの解析モデル第 3 節 JMPによるデータのグラフ化

3 第 1 章複数の誤差第 1 節はじめに実験データには複数の誤差が含まれる血圧の場合を考えてみよう測定を 2 回繰り返すと微妙に食い違いが生じるいわゆる測定誤差である毎日同じ時刻に 3 回の測定して平均値を比較した場合にも食い違いが生じるいわゆる個体内誤差である測定の対象が異なれば血圧も異なるさらに実験のランダム化の手順によってもいくつかの実験誤差が生じる統計的検定手法は一般的に考慮する誤差が一つであることを前提にしているところが少し手の込んだ実験によって得られたデータにはこれらの誤差が複合して入り込んでいいて単純な統計手法の適用では処理法間の統計的な差を検出できない場合がある幾つかの事例を通じて複数の誤差を統計的に分離しそれを用いて処理法間の比較の方法を紹介する第 2 節統計ソフト統計解析を実際に行う手段の変遷は目まぐるしい統計解析を職業としている人たちは SAS を使い統計学の研究者たちは S-Plus を好み社会科学系の研究者は SPSS を愛好し医学系の研究者たちの間では StatView あるいは国産の Fisher が好まれ国内の生物実験系では Muscot が一時的に広まった一般の統計ユーザたちは Basic による統計手法シリーズから Excel による統計手法シリーズに流れ込んでいるさてこのセミナーでは日本ではマイナーな JMP を使用するこれは統計解析を職業としている高橋が実験研究を職業としている人たち一般の統計ユーザたちさらには臨床試験に携わっているすべての関係者にとって最も強力なデータ分析ツールと確信したからである

4 JMP は日本科学技術連盟の実験計画法セミナーの講義実習でも採用されまた臨床データマネージメントセミナーでも使用されている最近は日本ロシュ内部の統計実践セミナーにおいていわゆる臨床担当者薬事担当者にも JMP を用いた教育を高橋が始めた 1999 年 7 月医薬安全研の定例会の前に高橋の私的なセミナーとして薬理学的活性の評価生物検定法の古典を思い出そうを開催したそこで生物検定法の代表的な方法である質的反応に対する効力比とその信頼区間の計算実習に JMP を用いた一般的な統計ソフトでこの問題に対応しているのはたぶん JMP のみであろう第 2 回目でも JMP を計算実習に使用するこれは複数の誤差を含んだ統計モデル線形混合モデルが JMP で使えるからであるこれまでは SAS の MIXED プロシジャが高橋はさまざまな分割実験の解析および経時データの解析に適用できることを紹介してきたのであるが先にも述べたように SAS は一般の統計ユーザに普及していないので今回も SAS ではなく JMP を使用するなおこの実習の機材の提供は日本科学技術連盟設置にはユックムス ( 株 ) 会場の提供は医薬安全研のご好意によっているまたここで使用する JMP バージョン 4 のβバージョンは SAS ジャパン JMP 事業部から提供を受けた第 3 節今回のテーマ複数の実験誤差が存在するがそれらが埋没しており一見しただけでは時計手法が誤用されていても分かりにくいような事例を取り上げたそれらの誤差構造を明示し JMP を用いて線形混合モデルによる誤差の計量を経験してもらうそれにより多くの実験に含まれる誤差について見識を深める切っ掛けとなることを期待している 1. 心不全ブタにたいする降圧剤の逐次増量による薬効評価 2. アトロピンによるウサギの流延抑制乱塊法による用量反応 3. モルモット摘出回腸のヒスタミン誘発収縮反応 4.E max 法による D 5 の推定 D 5 による用量反応関係の表示新しい実習の試みを行う実習データはこの文書ファイルの写しにあるこのデータを JMP にコピー & ペーストし JMP の結果を文書ファイルにペーストすることを主体にする

5 第 2 章逐次増量実験第 1 節逐次増量の例心不全ブタにおけるA 薬とB 薬の降圧効果を持続点滴増量法により得られた経時データを表 1 に示すさらに投与終了後の回復過程を観察している各薬剤の平均値の経時推移を図 1 に示す A 剤は 1 mg/kg/min 3 mg/kg/min まで用量の増加を反映して血圧の下降しているが 1 mg/kg/minでは更なる下降には陰りが見えている B 剤は 1 mg/kg/minから下降が観察されている投与後 3 分間での血圧の戻りは A 剤では戻りが遅いが B 剤では血圧が低下している時間が A 剤に比べ短いこと血圧の絶対値が高いことを無視すれば血圧の戻りが速やかである表 1 心不全ブタに対する血圧下降作用血圧 (mmhg) 時間経過分 15 分 3 分 45 分 6 分 75 分 9 分 15 分 12 分投与順薬剤の種類個体番号投与前投与量 1 mg/kg/min 投与量 3 mg/kg/min 投与量 1 mg/kg/min 投与なし 1: 溶媒 :A 剤 :B 剤

6 投与前の薬剤の種類はなしである t 3 h e m 3 3 e 1 a 3 n 1 1, Y mg/kg/min 3 mg/kg/min vvvvvvvvvvvvvvvvv 1 mg/kg/min vvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvv vvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvv min 図 1 心不全ブタに対する血圧下降作用 1: 対照群 2: A 薬 3: B 薬この実験データの統計解析の計画を考える前にこの実験の主たる目的が何であるかが分からないと適切な解析計画は立てられない事後的ではあるが B 薬を標準薬として新規化合物 A 薬の効果が B 薬の効果発現用量として知られている持続点滴 1 mg/kg/min の 1/3 で同等の効果が得られることを証明したいとしようまた効果の発現は 1 分までに現れるそれ以後は定常状態になることが一般的であるとしよう実際の実験では証明したいこと以外に実験が適切に行われていることを示すデータ実験の仮説が証明できない場合に備えて幾つかの付加的な条件でのデータが取れるように計画されている

7 第 2 節誤差の構造溶媒群の No.1 の症例を取り上げてみようデータの構造は次のようであるデータの構造時間投与量薬剤データ μ + s i + α j + β k + (αβ) jk + e ijk + e ijkl 投与前 - 11 μ + s i + α + β + (αβ) + e i + e i1 15 分 1 溶媒 17 μ + s i + α 1 + β 1 + (αβ) 11 + e i11 + e i111 3 分 1 溶媒 15 μ + s i + α 1 + β 1 + (αβ) 11 + e i11 + e i 分 3 溶媒 18 μ + s i + α 1 + β 2 + (αβ) 12 + e i12 + e i121 6 分 3 溶媒 15 μ + s i + α 1 + β 2 + (αβ) 12 + e i12 + e i 分 1 溶媒 17 μ + s i + α 1 + β 3 + (αβ) 13 + e i13 + e i131 9 分 1 溶媒 11 μ + s i + α 1 + β 3 + (αβ) 13 + e i13 + e i 分 - 11 μ + s i + α 1 + β 4 + (αβ) 14 + e i14 + e i 分 μ + s i + α 1 + β 5 + (αβ) 15 + e i15 + e i141 ここで μ : 総平均 s i : 個体の変量効果 ( 個体間誤差 ) i :i = 1, 2,..., 18 個体番号 α j : 薬剤の効果 α は投与前 α 1 は溶媒 α 2 はA 薬 α 3 はB 薬 j :j =, 1, 2, 3 薬剤の種類 β k : 増量効果 (αβ) jk : 交互作用 k :k =, 1, 2, 3, 4, 5 投与順 w ijk : 個体内誤差 : 測定誤差 e ijkl このようにデータの統計モデルができれば線形混合モデルにより解くことができる第 3 節 MIXED プロシジャによる解 proc mixed data=d1 ; class ID G2 DOSE ; model Y = G2 DOSE G2*DOSE / ddfm=satterth solution ; lsmeans G2*DOSE / diff=control('' 'D') cl ; random ID ID*G2*DOSE / solution ; run ;

8 用いたデータセット OBS ID G DOSE TIME T G2 Y D D D D D D D D123a D123a : : D D D D D D D D123a D123a 基本統計量 DOSE D123a- D123a- D D1 D12 D G ALL 1 N MEAN STD N MEAN STD N MEAN STD ALL N MEAN 誤差分散の推定値 Covariance Parameter Estimates (REML) Cov Parm Estimate ID ID*G2*DOSE Residual 個体間分散 = = 個体内分散 = = 誤差分散 = =5.49

9 固定効果の推定値 Solution for Fixed Effects Effect G2 DOSE Estimate Std Error DF t Pr > t INTERCEPT a G a1 G a2 G a3 G b DOSE D..... b1 DOSE D b2 DOSE D b3 DOSE D b4 DOSE D123a b5 DOSE D123a (ab) G2*DOSE D..... (ab)11 G2*DOSE 1 D : (ab)35 G2*DOSE 3 D123a 変量効果の推定値 Solution for Random Effects Effect ID G2 DOSE Estimate SE Pred DF t Pr > t s1 ID s2 ID : s18 ID w1,, ID*G2*DOSE 1 D w1,1,1 ID*G2*DOSE 1 1 D : w18,3,5 ID*G2*DOSE 18 3 D123a 固定効果の検定 Tests of Fixed Effects Source NDF DDF Type III F Pr > F A G B DOSE A*B G2*DOSE 最小 2 乗平均 Least Squares Means Effect G2 DOSE LSMEAN Std Error DF t Pr > t Alpha Lower Upper (ab) G2*DOSE D (ab)11 G2*DOSE 1 D G2*DOSE 1 D G2*DOSE 1 D G2*DOSE 1 D123a G2*DOSE 1 D123a (ab)21 G2*DOSE 2 D G2*DOSE 2 D G2*DOSE 2 D G2*DOSE 2 D123a G2*DOSE 2 D123a (ab)31 G2*DOSE 3 D G2*DOSE 3 D G2*DOSE 3 D G2*DOSE 3 D123a G2*DOSE 3 D123a

10 投与前値との差についての最小 2 乗平均 Differences of Least Squares Means Effect G2 DOSE _G2 _DOSE Difference Std Error DF t Pr > t Alpha Lower Upper G2*DOSE 1 D1 D G2*DOSE 1 D12 D G2*DOSE 1 D123 D G2*DOSE 1 D123a15 D G2*DOSE 1 D123a3 D G2*DOSE 2 D1 D G2*DOSE 2 D12 D G2*DOSE 2 D123 D G2*DOSE 2 D123a15 D G2*DOSE 2 D123a3 D G2*DOSE 3 D1 D G2*DOSE 3 D12 D G2*DOSE 3 D123 D G2*DOSE 3 D123a15 D G2*DOSE 3 D123a3 D 結果の要約溶媒の投与による血圧の変化は 1mmHg の範囲であり有意な変化ではない B 薬は 1mg/kg/min で mmhg と有意な変化があった A 薬は 3mg/kg/min で mmhg と有意な変化があた用量反応的に表現すれば B 薬 1mg/kg/min と同等の効果を得る A 薬の用量は antilog1(.22) = 1.6mg/kg/min であり B 薬の 1/6 で同等の効果が得られるただし用量反応の傾きが異なるのでその比は一定でない -2.5 溶媒 y B 薬 -1. A 薬 L1_X 図 2 投与前値からの LSMEAN の差のよる用量反応

11 第 4 節 JMP による実習 A 薬のデータに限定して JMP の新しいバージョン 4 のβ6 版による線形混合モデルの実習を行うこれは前節のモデルの解析が JMP のエラーにより実現できないので便宜的な対処法であることと線形混合モデルの入門としては簡単な問題の方がよいとの判断にもよる図 3 SAS データセットから JMP への取り込み

図 4 線形混合モデル Random の指定 Response Y Summary of Fit Rsquare.96221 RSquare Adj.896452 Root Mean Square Error 2.63127 Mean of Response 1.

12 図 4 線形混合モデル Random の指定 Response Y Summary of Fit Rsquare RSquare Adj Root Mean Square Error Mean of Response Observations (or Sum Wgts) 54 Analysis of Variance Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Model Error Prob > F C. Total <.1 Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept <.1 ID[7] ID[8] ID[9] ID[1] ID[11] ID[12]

13 DOSE[D] <.1 DOSE[D1] <.1 DOSE[D12] DOSE[D123] <.1 DOSE[D123a15] REML Variance Component Estimates Random Effect Var Ratio Var Component Std Error 95% Lower 95% Upper Pct of Total ID&Random Residual Total LogLikelihood = Effect Tests Source Nparm DF DFDen Sum of Squares F Ratio Prob > F ID&Random <.1 Shrunk DOSE <.1 Tests on Random effects refer to shrunken predictors rather than traditional estimates. Effect Details ID&Random Least Squares Means Table Level Least Sq Mean Std Error Mean DOSE Least Squares Means Table Level Least Sq Mean Std Error Mean D D D D D123a D123a LS Means Plot D D1 D12 D123 D123a15 D123a3 YLS Means DOSE

14 LSMeans Differences Student's t Alpha=.5 Q= LSMean[i] By LSMean[j] Mean[i]-Mean[j] Std Err Dif Lower CL Dif Upper CL Dif D D D D D123a D123a D D1 D12 D123 D123a15 D123a

15 第 3 章アトロピンの逐次増量第 1 節適切でない実験データの解析統計の応用分野で適切でない統計解析の事例をよく目にする多くは適用している統計手法が前提にしている仮定とのミスマッチである高橋も駆け出しのころ臨床試験データの解析で 1 標本の問題を 2 標本の問題として解くプログラムを書き結果を報告したこともある気が付いたときはすでに遅しであった適切でない統計解析の事例は各学問分野でその分野の典型的な実験データの解析を解説している教科書にも散見するこれは教科書が出版された当時の統計の教科書にその分野で広く行われている実験データを適切に解析する方法が述べられていなかった場合統計の理論はあったが計算手段がない場合に実験にも起きる薬理試験の分野で同一検体または同一個体内での逐次増量による試験が in vitroに限らずin vivoの試験でも多用されているこの章では医薬品研究法文献 1) で述べられている古典的な解析事例の問題点を指摘し近代的な統計解析法を示す第 2 節ウサギの流延抑制文献にはマグヌス装置を用いた摘出臓器に対する薬物の用量反応曲線の推定に Lack of Fitの解析を含む回帰分析による計算手順が示されているこの計算例としてアトロピン投与によるウサギの流延抑制が示されている表 2 にデータを示すこのデータから用量反応関係を示そうとしたときに回帰直線の当てはめについての統計的な知識がありコンピュータによる計算プログラムが手元にあった場合にそれ以上の統計的素養がなければ迷わずアトロピンの用量を横軸に抑制率を縦軸にした散布図を作成し回帰直線を当てはめ実験結果を要約し解釈するに違いないこの回帰分析の統計的問題点は第 1 は 1 羽のウサギに 4 用量を投与しているにもかかわらずそれを無視して 4 羽に異なる用量を投与して得られたデータと見なす手法

16 を適用していることである第 2 は投与量を逐次的に増量しているにも係わらずランダムに投与したことを前提にした統計手法を適用していることである表 2 を見ただけでは第 2 の問題があるか否かは分からない第 3 は抑制率には下限と上限があり薬理反応はその範囲内でシグモイド曲線になり回帰直線を当てはめて良いか吟味が必要であるが無視されている表 2 アトロピン投与によるウサギの流延抑制アトロピン (μg/kg) 投与後の % 抑制ウサギ計計平均古典的な生物検定法によりこのデータの解析法を考えると 1 羽ごとのウサギから 5% 抑制用量を推定してその平均値と 95% 信頼区間を計算するならば生物検定法的にいえば直接法 (Direct Assay) の問題であるこのような方法ならば統計的には正しい方法である第 3 節 JMP によるデータのグラフ化 MS-Wordの表 2 のデータをコピー & ペーストでJMPの表に貼り付けてみよう結果を図 5 に示すコピーするデータはウサギの番号と抑制データのみである図 7 では変数名を投与量に変更している途中である

に選択 OK の選択手のツールを選択 Distribution Uniform Scaling の選択

17 図 5 JMP にペーストし変数名の変更図 6 棒グラフとボックスプロットこの図は JPM でテーブルメニューの Analyze Distribution の選択投与量を Y Columns に選択 OK の選択手のツールを選択 Distribution Uniform Scaling の選択手ツールで棒の幅の調整テーブルメニューの Edit Copy の選択 MS-Word でのペーストをしたものである

スタック機能によるデータの転置変数 x の属性の変更 log の計算変数 x の属性を N から C への変更する手順 : x の選択右クリック Column

18 図 7 1 行 1 データの形式への変換この図は JPM のテーブルメニューの Tables Stack の選択投与量を Named of id COL に x の入力 Name of stacked cols に y の入力変数を選択して Stack をクリックして Stack 変数領域への移動をしている図 8 スタック機能によるデータの転置変数 x の属性の変更 log の計算変数 x の属性を N から C への変更する手順 : x の選択右クリック Column Info の選択 Data Type を Character から Numeric へ変更 Modeling Type を Noninal から Continuous への変更する

19 図 9 変数の追加と変数変換変数変換はテーブルメニューの Cols Fomura で実施する Log1 は Transcendental( number. 1 の中に入っている ) 図 1 スプライン関数によるウサギごとの用量反応投与量が増加すると反応が 1% で頭打ちになっていることが観察される 1

20 図 11 回帰直線の当てはめと 95% 信頼区間 + 字ツールで 95% 信頼区間を読み取ると (.37.74) が得られる Lack of Fit1 の結果から直線の当てはめは支持される図 12 ウサギごとに回帰直線の当てはめ

21 図 13 経験ロジットの生成 P* = (y +2.5) / (1+5) logit* = log1 ( p* / (1 p* )) 図 14 経験ロジット変換後の回帰の当てはめ

22 図 15 Fit Model による交互作用の検討交互作用は n.s. である図 16 平行な回帰直線の当てはめ

23 図 17 推定値のデータシートへの保存図 18 推定値の出力結果

24 表 3 ED5 の計算 No m a b -(m+a)/b 平均.5 VAR.14 SD.37 SE.13 文献 1) 伴義男岡本敏彦北川晴雄ほか編 (1974) 医薬品研究法朝倉書店.

25 第 4 章摘出回腸の収縮第 1 節マグヌス装置による実験高橋自身はマグヌス装置を見たことがないのであるが浦川紀元監修の平滑筋の薬物反応 IV 章平滑筋実験法 p25 の次の記載により抽象的に理解をしているモルモット摘出回腸を 37 で通気した 2mL の organ bath に懸垂し ACh を収縮薬として用いることにするエーザイの小野さんから提供されたモルモット摘出回腸のヒスタミン誘発収縮反応に及ぼす影響のデータをしめす表 4 ヒスタミン収縮実験順処置最大ヒスタミン添加量 ( 単位はμM) 測定値: 収縮高 (mm) G 薬収縮高 R1 1 蒸留水 μM μM μM R2 5.1μM μM μM 蒸留水実験手順実験データの解析法は実験手順によって異なる提供されたデータには手順が示されてたいなかったが薬理実験の解説書などから類推して手順を示す手順 1)8 匹のモルモットから回腸を摘出する手順 2) マグヌス装置に回腸を 1 検体ごとに懸垂しヒスタミン濃度が 3 μm となるまでゆっくりと添加し懸垂した回腸の収縮量を最大収縮高とするこれを 4 件体分行う

26 手順 3) 回腸中のヒスタミンを洗浄する手順 4) 蒸留水 3 用量の濃度に調製された G 薬を準備する蒸留水をマグヌス装置に注入し手順 5 での実験を行い G 薬の低濃度から手順 5 を繰返す手順 5) マグヌス装置にヒスタミン濃度が.1 μmとなるように添加し回腸の収縮速度が止まったら次にヒスタミン濃度が.3 μmとなるように添加し最後にヒスタミン濃度が 3 μmとなるまで添加するこの間の回腸の収縮量を連続的に記録する手順 6) 手順 2 に戻るただし手順 4 で G 薬の 3 用量を先に行い蒸留水は最後とする第 2 節実験データの解析モデルランダムに選ばれた 8 匹のモルモットから摘出された回腸はランダム効果と考えられるその検体を 4 本ごとに分けてそれらを蒸留水と G 薬の 3 濃度溶液に割り付けるその 1 回腸ごとにヒスタミンを 3.3 倍の濃度となるように逐次増量し回腸の収縮量を計測しているこれを残りの 4 本の回腸についても同様に実施した実験に先立ってヒスタミンの 3.3 倍の逐次増量はランダムな単回投与の結果が一致し増量前の影響の持ち越し効果がないことが確かめられているとするこの実験で知りたいことはヒスタミンを完全活性薬としたときに G 薬の存在下でのヒスタミンによる回腸の収縮の用量反応が平行移動傾きが平坦化のどちらかを知りたいのであるそして平行移動ならば G 薬が存在しないときのヒスタミンの用量反応曲線を基準にして常用対数目盛りで.31 右にシフトさせる G 薬のモル濃度 (pa 2 ) を推定したいのであるこのような実験目的を勘案してデータの構造は y ijk = μ + r i + s ij + α k + x + (α x) k + e ijkl + e ijkl ここで μ : 総平均 r i : 反復 i :j = 1, 2 実験の反復 s i : 個体の変量効果 ( 個体間誤差 ) j :j = 1, 2,..., 8 個体番号

27 α k :G 薬の効果 k :k =, 1, 2, 3 G 薬の用量 x : ヒスタミンの用量 (α x) k : 交互作用 l :i = 1, 2,..., 8 ヒスタミンの用量変更数 e ijkl : 誤差このようにデータの統計モデルができれば線形混合モデルにより解くことができる第 3 節 JMP によるデータのグラフ化 MS-Word の表 4 のデータをコピー & ペーストで JMP の表に貼り付けてみよう結果を図 19 に示す図 19 JMP への取り込み変数名はヒスタミンの投与量に変更した

28 図 2 1 行 1 データへ形式への変換図 21

29 図 22 図 23

30 図 24 図 25

31 図 26 図 27

32 図 28 図 29

33 図 3 図 31

201711grade2.pdf

201711grade2.pdf 2017 11 26 1 2 28 3 90 4 5 A 1 2 3 4 Web Web 6 B 10 3 10 3 7 34 8 23 9 10 1 2 3 1 (A) 3 32.14 0.65 2.82 0.93 7.48 (B) 4 6 61.30 54.68 34.86 5.25 19.07 (C) 7 13 5.89 42.18 56.51 35.80 50.28 (D) 14 20 0.35

第2回 複数の誤差を持つ実験データ

第2回複数の誤差を持つ実験データ