Microsoft PowerPoint - Takafumi-webinar_Illuminas_16S_r2

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1 NGSの新たな利用法 :16S rrnaメタゲノム解析のポイントプロトコールのご紹介 May 9, 2014 小林孝史イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 Illumina s 16S rrna メタゲノム解析のポイントプロトコールのご紹介 本資料はwebinar 後 下記リンク上にアップロードいたします イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト小林孝史 2014 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, IlluminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, NuPCR, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, TruSight, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

3 本日のウェビナー概要 なぜ 16S rrna シーケンスを行うのか? Illumina 公式 16S rrna メタゲノム解析 Protocol について ( 簡単に )16S 解析 : MiSeq Reporter で行うデータ解析と分類レポート 16S rrna シーケンス解析実用例 日本語サイト : 論文集 (pdf): 英語 webinar(youtube): 7

4 微生物を集団で解析する = メタゲノム解析 さまざまなアプリケーションに応用! 土壌 水質サンプル中の微生物解析発酵食品中に含まれる微生物ゲノム解析食品中に含まれる混入微生物のゲノム解析下水道 工場敷地内の土壌などからの微生物解析化石サンプルなどから古 ( 微 ) 生物解析体内臓器 糞便に含まれる微生物解析 8

5 メタゲノムアプリケーション 16S を解析する方法 (16S シーケンス解析 ) と ショットガンで全ゲノム解析をする方法がある PCR amplify Tag gene (16S rrna) Shotgun Library Easy Rapid Inexpensive Detect rare Phylotypes No functional data High output Long reads Expensive High resolution functional data 9

6 なぜ 16S rrna シーケンスを行うのか 16S rrna はすべてのバクテリアで持つ配列である 16S rrna は多様性を持つ配列である 従って 16S rrna 配列を調べることにより その情報から含まれる微生物を検出 同定することができる ( 菌叢解析 ) Fox GE et al. (1977) PNAS 10

7 16S rrna シーケンス 16S rrna は 1,542 塩基長の原核生物のリボソーム RNA の一部である ( 真核生物の場合は 18S となる ) 16S rrnaは種を超えていくつかの保存性の高い領域を持つ その中で系統樹的に変異が遺伝されている 従って この領域を解析することにより含まれる微生物の種類を遺伝学的に同定できる 微生物の同定やゲノム解析に対して非常に有用なツールとして有用である 11

8 Illumina 公式 16S rrna シーケンスプロトコール 12

9 ワークフロー 16S rrna について最適化されたアプリケーション サンプル調製 V3 V4 領域の増幅 ライブラリー調製 MiSeqでシーケンス データ解析 13

10 ターゲット領域とプライマーをどこに設計するか 1) 2) 1) David AW Soergel, et al., Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rrna gene sequences. The ISME Journal (2012), 1 5 2) Klindworth A, et al., Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res (2013), 41(1) 14

11 16S Metagenomics Sequencing Library Preparation Illumina 公式プロトコール イルミナで公式にリリースした 16S rrna 菌叢解析プロトコール 16S 解析用のライブラリー調製プロトコール V3-V4 領域を含む460bpを増幅解析 ( 以前のプロトコールはV4 領域のみ254bp) MiSeq V3 kit 2x301 Cycleでのランを想定 (Read 長を考慮してV3キットを推奨 ) MiSeq ReporterとBaseSpace (coming soon) でMetagenomicsワークフローを使用する ほかのターゲット領域にも使用できるプロトコール 領域特異的なプライマーを用いたTailed-PCR 法 公式のユーザーガイドにはプライマーの Tm 値も記載されているので他の領域の増幅にも適応可能です プロトコール (pdf): 15

12 プロトコール概要 : ユーザーガイドを用意しています プライマーを注文する V3とV4 領域を含むプライマーにより 25 cycle PCRで460 bpの断片を増幅する ライブラリー調製 Nextera XT index kitを使用して 8 cycle PCRでアダプターを付加する MiSeq でシーケンス 384サンプルの同時解析 (MiSeq 1ラン ) で 高いクオリティーの全長 V3, V4 領域のオーバーラップリードがサンプルごと35,000-60,000リード得られる (MiSeq V3 kit 使用 ) MSR あるいは BaseSpace で 2 次解析 MiSeq Reporterのメタゲノムワークフローを使用すれば Greengenesデータベースを参照にした分類学的同定が可能 属 種のレベルまでグラフを含むレポートとして得られる 16

13 16S プロトコール用プライマー配列 V3-V4 領域を解析するためのプライマー情報 Forward Primer: 5ʹ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG オーバーハング配列 16S V3-V4 領域に特異的な配列 Reverse Primer: 5ʹ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC 緑の配列は Tailed-PCR に必ず必要な配列 赤の配列は領域特異的な配列を示す (16S V3 V4 領域内や 対象のアンプリコン領域 ) プライマー精製レベルはカートリッジ精製程度で構わない 17

14 任意のターゲット領域を増幅させるためのプライマー 16S の他の領域を増幅させる Forward Primer: 5ʹ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG- { ターゲット領域特異的な配列 } オーバーハング突出配列 ターゲット領域特異的な配列 Reverse Primer: 5ʹ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG- { ターゲット領域特異的な配列 } プライマーの 5 末端に緑の配列を付加する ターゲット領域は特定の領域を示す ターゲット領域 <~550bp PCR 断片 18

15 Step 1: 目的の領域を増幅する 1 番目の PCR 5 末端にオーバーハング配列を含むプライマーを使用 Tailed PCR でオーバーハング配列をつける 16S V3-V4 領域か カスタムアンプリコンに特異的な配列 F ゲノム DNA (5ng/uL, 2.5uL) ターゲット領域増幅のため 25 Cycle の PCR 反応 R 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix による増幅 ( 日本ジェネティクス社様より入手可能 ) 16S V3-V4 領域を増幅した場合 550bp の断片として得られる 50uL の PCR プロダクト ( 余剰プライマーを除く AMPure Beads 精製後 ) のうち 5uL を次の PCR 反応に用いる 19

16 Step 2: イルミナ Nextera XT Index Kit を使用して シーケンスに必要なアダプター配列を付加する Nextera XT Index kit プライマー ( 最大 384 種類のインデックス可能 ) 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix による増幅 ( 日本ジェネティクス社様より入手可能 ) タグ付加のみの 8 Cycle の PCR 増幅 P5 Index 2 16S V3-V4 領域か 任意のターゲット領域がインサートとしてシーケンス解析される Index 1 P7 16S V3-V4 領域を増幅した場合 630bp のライブラリーが調製される 余剰プライマーを除く AMPure Beads 精製後 25uL の溶液として産物が得られるため 一部を変性してプールする 20

17 全体のワークフローまとめ 16S rrna シーケンス ( 参照 ) アプリケーションノート appnote_miseq_16s-j.pdf 21

18 16S rrna シーケンス サンプルの抽出方法 22

19 どの製品を使用するか? 環境サンプルから DNA を抽出して 16S シーケンスを行う場合 ワークフロー アプリケーション サンプルの由来 DNA の抽出 ライブラリー調製シーケンスデータ解析 土壌サンプル SoilMaster DNA Extraction Kit* V3-V4 領域を増幅するプライマーを用いた Illumina 公式の 16S プロトコール 土壌サンプルおよび水質サンプルの 16S シーケンス解析 Meta-G-Nome DNA Isolation Kit or Water Kit* 16S 遺伝子の特定領域にデザインされたプライマー Nextera XT Indexing Kit MiSeq BaseSpace, MSR, その他解析ツール 水質サンプル WaterMaster DNA Purification Kit* EPICENTRE ILLUMINA *EPICENTRE 社のウェブサイトを参照 23

20 どの製品を使用するか? ヒトサンプルから DNA を抽出して 16S シーケンスを行う場合 ワークフロー アプリケーション サンプル由来 DNA の抽出 ライブラリー調製シーケンスデータ解析 糞便サンプル ExtractMaster Fecal DNA Extraction Kit* V3-V4 領域を増幅するプライマーを用いた Illumina 公式の 16S プロトコール ヒトのサンプルからの 16S シーケンス解析 QuickExtract DNA Extraction Kit* 16S 遺伝子の特定領域にデザインされたプライマー Nextera XT Indexing Kit MiSeq BaseSpace, MSR, その他解析ツール 口腔内サンプル BuccalAmp DNA Extraction Kit* EPICENTRE ILLUMINA *EPICENTRE 社のウェブサイトを参照 24

21 16S rrna 解析サンプルは Low Diversity サンプルとなります Low Diveristy サンプルなため Intensity が上下します 通常の解析に比べて Q score が若干低くなります 25

22 Low Diveristy サンプル PhiX( コントロール DNA) の添加が必須です MiSeq Control Software v2.3 以上を推奨 % Base V3 kit 使用の K/mm2 にて PhiX 5% 添加で解析可能 オーバークラスター (1000K/mm2 超 ) で Quality を下げやすくなるため通常は PhiX 20% スタートをお勧めします クラスター密度が安定してきたら徐々に下げていきましょう こちらのサポートウェビナーもご参考ください! 26

23 主なトラブルシュートの例 収量が小さい AMPure Beads のハンドリング PCR 増幅効率が悪い Input DNA の Quality/Quantitiy をチェックする ( 公式の配列以外を使用 ) プライマーの再設計クラスター数が得られない ( データ量小さい ) ng/ul nm の単位変換を確認 変性時の 0.2N NaOH の ph が 13 以上であることを確認しましょう ライブラリー長のチェックを行いましょう Index の振り分けがうまくできない Index の組み合わせを確認しましょう 27

24 16S rrna 解析 : データのアウトプット 28

25 MiSeq 標準装備の Miseq Reporter で作成される 16S Metagenomics Report MiSeq Reporter で 16S metagenomics workflow で解析された際に出力されるレポート html 形式で任意のウェブブラウザーで閲覧可能 MiSeq Reporter 2.4 からインターフェイスがリニューアル サンプルごとに Read 数と占める割合が表示される 他のサンプルとの集計の比較が可能 29

26 16S rrna 解析 : 出力データ レポート中の Sunburst Classification Chart 解析の目的 : 配列のFASTQファイルの作成 それぞれのリードに対する分類同定 サンプルごとに分類結果をグラフ化 サンプルごとの集計比較をグラフ化 2 つのパイプラインでの解析を推奨 : クラウドで行うBaseSpace での解析とレポートの作成 ( 近日リリース!) MiSeq 標準装備のソフトウェアMiSeq Reporter レポート中の Top 20 Classification Results by Taxonomic Level 30

27 MiSeq Reporter (MSR) 上でのデータ閲覧 生データへのアクセスが簡単 グラフと実データを並べて閲覧できる 31

28 BaseSpace 16S Analysis Overview( 近日リリース!) Raw sequencing data Primary Analysis (create FASTQs) Read classification Outputs: PDF Reports Statistics calculation Metagenomics report creation Raw data output files (CSV) BaseSpace Summary Pages with interactive visualizations 32

29 BaseSpace 16S Analysis ( 近日リリース!) BaseSpace 上のappを使用して cloud 上で簡単に解析できる機能としてはMiSeq Reporterと同等共同研究者の方とのデータ共有 ( 配列データ レポート ) が簡単 33

30 16S rrna 菌叢解析実用例 :1 Melissa Spears 34

31 16S rrna 菌叢解析の実例 ユーザー :GEORGE WEINSTOCK/ERICA SODERGREN The Genome Institute at Washington University, St. Louis, MO 研究対象 : 臨床サンプルからの 16S rrna シーケンス解析 ( 特に可変領域の解析 (V1-V3 and V3-V5)) 今回のプロジェクト : 既知の微生物サンプルを用いて MiSeq V3kit (2x301 cycle) と Roche 社 454 とのパフォーマンスに比較を行った 今まで使用していた 454 との時間とコスト面での比較 35

32 16S rrna 菌叢解析の実例 結果について ユーザーからのフィードバック 操作性 : MiSeq は 454 に比べて操作性に優れている ( 簡単!) ~88% のリードで Read1 と Read2 のアッセンブルが可能 コスト : MiSeq で最終的にかかったサンプル単位のコストは 454 使用時のなんと 1/ で計上された! アウトプット量 : 454 に比べて ~20x のカバレッジが得られた 36

33 ターゲット領域の検討 Human Microbiome ProjectはV3 V5 領域を使用している V1 V3 領域はほとんど同一配列であり 現在の解析ではあまり使用されることはない V3 V5 領域は若干長いため V1 V3 領域に比べてMiSeq V3キットの2x300bpでのアッセンブリー配列の作成に向かない V3 V5, 569bp, 2x300bpでの解析には若干長い ( オーバーラップ領域が短い ) V1 V3, 507bp, 長さ的には適している ほかの領域はどうか?: V4 領域 ( イルミナシーケンサーでよく使用される配列 ) V1 V2 領域 ( 増幅されにくいサンプルによく使用される短い配列 ) V6 V9 領域 (HMP 種などの同定には向かない配列 ) TGI 推奨 : V1 V3 領域 ( 複数のコミュニティーとのディスカッションを経る ) 37

34 ターゲットの比較 ターゲット種レベルでの正確性属レベルでの正確性 全長 92% 94% V1-V3 (507bp) V3-V5 (569bp) V6-V9 (524bp) V1-V2 (310bp) V4 (219bp) Thanks to Bo-Young Hong and Patricia Diaz, Univ. Conn. Health Center. 830 sequences from the Human Oral Microbiome Database classified using mothur/rdp. 38

35 MiSeq V3 kit (2x300bp) 16S rrna 解析データ Read 1 Read 2 Tag a 16S rrna V1-V3 ~500 bases Tag b アッセンブルされた V1-V3 領域 ( 独立した Stitch Read として ) 39

36 16S rrna 菌叢解析のワークフロー サンプル調製 V1-V3 領域 27F-534Rを ~507 bpのアンプリコンとして増幅 ライブラリー調製 ホームブリューで実施 (TruSeq に沿った方法 ) MiSeq MiSeq V3 kit- 2 x 301 cycle データ解析 BAM-FASTQ trim <q10 3 end quality trim adapter trim RDP Identity Overlap consensus reads (20nt/10 nt) PhiX identity 得られた結果 臨床学的な見地からそれぞれのバクテリアを同定する 40

37 サンプル 属レベルで同定されたRead % 0.5 CONFIDENCE MiSeq Assembled 43, Pool 1 3, Pool 2 4, CONFIDENCE MiSeq Assembled 427, Pool 1 3, Pool 2 4, CONFIDENCE MiSeq Assembled 419, Pool 1 3, Pool 2 4, CONFIDENCE MiSeq Assembled 409, Pool 1 3, Pool 2 4, 結論として 454 に比べて MiSeq V3 kit 使用時の方がより正確に多くの微生物の同定に成功した 41

38 結果 : V1 V3 アンプリコン (~500bp) 20 M ペアエンドリード ( パスフィルター後 ) 9.7 Gb > Q % Clusters PF 42

39 結論 ワシントン大学では Human Microbiome Project においてプライマーを独自に設計し 16S シーケンス解析のプロトコールを検証を行った ユーザーは MiSeq を導入することにより 最終的に時間とコストの節約に成功した 以前までの 454 を用いた方法に比べて 良好なクオリティー 大きなアウトプット量 協力 謝辞 : Weinstock Lab George Weinstock Erica Sodergren Brandi Herter Kathie Mihindukulasuriya TGI Illumina Production Matt Cordes 43

40 16S rrna シーケンスの実用例 : サバクゴファーガメの鼻腔に含まれる菌叢解析 Gary Nunn, Ph.D 44

41 サバクゴファーガメの例 SanDiego 動物園ではモハーヴェサバクゴファーガメの保護活動を行っている マイコプラズマ菌の感染による上気道炎が保護活動および生活地域の移転作業を妨げていた マイコプラズマ菌 (Mycoplasma): グラム陰性菌, 人においてもマイコプラズマ肺炎を引き起こす種類もある 45

42 サバクゴファーガメの保護に向けた SanDiego 動物園との共同研究 WILDLIFE DISEASE LABORATORIES Bruce Rideout, Director Josephine Braun, Scientist 目的は保護活動の妨げになる疾患を防ぐこと 具体的に下記のプロジェクトを行った 疾患の同定を行った 疾患に対する診断方法を確立した 下記の施設においてアウトブレークの危険性を伴う病原菌の同定を行った San Diego Zoo San Diego Zoo Safari Park Field conservation programs 46

43 健康なサバクゴファーガメから同定された微生物 (1) Rank Species Total # Sequences in sample Total % Sequences in Sample Notes 1 Calothrix parietina 106, % Blue-green algae 2 Rickettsia sp. 15, % Tick, flea, lice borne 3 Acinetobacter sp. 5, % Soil bacteria 4 Symploca atlantica 4, % Algae 5 Proteobacteria 4, % 6 Thiomonas thermosulfata Variable (some pathogen known) 3, % Extremophile 8 Blautia sp. 3, % Gut bacteria 9 Blautia coccoides 3, % Gut Bacteria 10 Pedobacter 2, % Soil Bacteria Other Species of note Mycoplasma agassizii % 47

44 疾患を持ったサバクゴファーガメから同定された微生物 (6) Rank Species Total # Sequences in sample Total % sequences in sample Notes 1 Mycoplasma agassizii 31, % Etiologic agent* 2 Myroides odoratus 11, % 3 Flavobacteriaceae sp. 11, % 4 Chelonobacter sp. 11, % Associated diseased tortoise ** 5 Pedobacter sp. 7, % Soil bacteria 6 Flavobacterium swingsii 5, % 7 Proteus penneri 5, % Invasive pathogen 8 Pseudomonas brenneri 4, % 9 Pseudomonas sp. 4, % Water borne biofilms 10 * Brown et al., 1994 ** Gregersen et al., 2009 Pseudomonas marginalis 4, % 48

45 疾患を持ったサバクゴファーガメから同定された微生物 (8) Rank Species Total # Sequences in Sample Total % sequences in sample Notes 1 Chelonobacter sp. 141, % 2 Chelonobacter oris 37, % Associated with disease tortoise ** 3 Mycoplasma agassizii 7, % Etiologic agent * 4 Granulicatella adiacens 5, % Normal human mucosal membranes 5 Flavobacteriaceae 5, % Water borne 6 Myroides odoratus 4, % Hm nosocomial infection 7 Pedobacter sp. 4, % Soil bacteria 8 Deinococcus sp. 2, % Soil, water 9 Flavobacterium swingsii 1, % Water borne 10 Proteus penneri 1, % Invasive pathogen * Brown et al., 1994 ** Gregersen et al.,

46 結論サバクゴファーガメの鼻腔内メタゲノム解析 サバクゴファーガメのほとんどは Mycoplasma agassizii 感染が見られた 9 匹中 8 匹で病原菌を検出した 9 匹中 7 匹の疾患を持つサバクゴファーガメの鼻腔には病原菌の占める割合がトップ 10に含まれていた Tortoise : 一番多く含まれているバクテリア (18.2%) Tortoise : 二番目に多く含まれているバクテリア (13.9%) Tortoise : 三番目に多く含まれているバクテリア (3.1%) 以前から上気道炎の原因となる病原体であることが知られていた Chelonobacter 種も多くのサバクゴファーガメの鼻腔で検出された 10 匹中 8 匹のサバクゴファーガメの鼻腔でこれら病原菌が多い方から10 種類に含まれていた Chelonobacter についても以前より上気道炎との関連が報告されていた 健康なサバクゴファーガメは土壌や水中に含まれる多様なバクテリアを有していた 健康なサバクゴファーガメには0.05% 程度しかMycoplasma agassiziiが含まれていなかった 50

47 その他 DNA 抽出キットその他 omic_sequencing_library_preparation.ilmn プロトコール デモデータなど 本資料はwebinar 後 下記リンク上にアップロードいたします プロトコールは 原則として弊社キットを使用した場合に比べてサポートの範囲が限られます ご利用にあたりましてはご了承の上ご利用ください 51

48 ご清聴頂き誠にありがとうございました しばらくご質問をいただく時間を設けます 52

49 サポートウェビナーにご参加いただきありがとうございました 本日のセッション終了後のご質問は で承ります 55