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かずしよせ
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1 2011 年 1 月次世代シーケンサーマイクロアレイマイクロアレイをどのように使いこなすか?

2 内容イントロダクション次世代シーケンサの広がりマイクロアレイアプリケーションの広がり幹細胞ゲノミクスを例として使い分けのポイント 'vs. RNA-seq( 感度ダイナミックレンジ精度コストカスタム化アジレント発現マイクロアレイの 3 つのラインナップ Gene Expression + lincrna ( 長鎖 non-coding アレイ ) mirna マイクロアレイ Gene Expression + Splicing variants (Exon アレイ ) Page 2

3 Microarrays achieved a rapid uptake, then NGS??? 核酸検出とシーケンス技術に関する論文の推移 Blotting Footprinting Microarray ChIP NGS What would you do if you could sequence everything?, Nature biotech. Oct., 2008 Page 3

4 マイクロアレイアプリケーションの広がり acgh ゲノムのコピー数変化 ChIPon-chip ChIPon-chip クロマチンによる発現制御転写因子やポリメラーゼとの関連 mrna 遺伝子発現の変化 Gene Expression エピゲノム ' メチル化 ( による制御 ncrna や Splicing による制御 CH 3 mirna lincrna Splicing variant 複数のアプリケーションにより一歩進んだ生物学的解釈を付与配列情報の変化の影響 SureSelect New Page 4

5 マイクロアレイ次世代シーケンサー使い分けの前提 Oligo DNA Microarray 既知のトランスクリプートムまたはゲノム配列からオリゴプローブを設計して搭載例 : 既知の遺伝子のプロファイリング Re-sequencing 読み取られた塩基配列を既知のリファレンスゲノム配列にマッピング例 : 未知の転写産物の同定 Page 5

6 例 : 幹細胞ゲノミクス研究分野 or 分化誘導の評価分化マーカの特定検出 mrna lincrna ES ips 細胞の選別特性の評価疾患モデルとして創薬スクリーニング等への応用樹立したiPSの評価 ips-ips ips-es 間などの比較脱分化のメカニズム解明 ' 遺伝子発現エピゲノム解析など ( 培養に由来するゲノム不安定性の確認細胞アッセイ mirna CH3 Splicing ChIP CGH アジレント自動化システム Page 6

7 Global gene expression analysisにより ES 細胞マーカと細胞間の発現 Similarityを確認 TiPS Cells :T cell derived ipscs 温度感受性センダイウイルスベクターを用いて OCT3/4, SOX2, KLF4, c-myc 導入末梢血由来のヒト終末分化循環 T 細胞から導入因子挿入の無い ips 細胞を樹立 Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用 Cell Stem Cell, (2010) Page 7

ES 細胞の分化時 self-renewal silencing に関わる mirna let-7c ( 体細胞に広く発現 ) は ES 細胞の self-renewal の silencing に関与 Drosha 通常の ES 細胞では他の mirna が self-renewal を silence する let-7 の働きを抑制している let-7

8 ES 細胞の分化時 self-renewal silencing に関わる mirna let-7c ( 体細胞に広く発現 ) は ES 細胞の self-renewal の silencing に関与 Drosha 通常の ES 細胞では他の mirna が self-renewal を silence する let-7 の働きを抑制している let-7 を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る -Myc +Myc Tissue, embryoid bodies (EB), ES の mirna 発現プロファイル Chen, C., et al., Mamm Genome (2007) 18: Collin Melton, C., et al., Nature (2010) 463 Page 8

転写制御因子からのアプローチ Polycomb タンパク質による Human ES 細胞の制御機構 Polycomb group protein の複合体 PRC 'H3K27 のメチル化を誘導 ( 構成要素 : EED, SUZ12 etc SUZ12 EED Growth/ Self-renewal H3K27me3 SUZ12 developmental regulators

9 転写制御因子からのアプローチ Polycomb タンパク質による Human ES 細胞の制御機構 Polycomb group protein の複合体 PRC 'H3K27 のメチル化を誘導 ( 構成要素 : EED, SUZ12 etc SUZ12 EED Growth/ Self-renewal H3K27me3 SUZ12 developmental regulators 上流域に結合し発現抑制に関与 ES 細胞多分化能維持に関わる転写制御因子 growth self-renewal 関連遺伝子上流域および developmental regulators 上流域に結合 developmental regulators Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用 Cell Apr 21;125(2):301-13, Lee TI et al. Page 9

10 培養ヒト ES 細胞 :karyotype では検出できなかった構造変化を CGH マイクロアレイで検出 Agilent CGH マイクロアレイ使用 Normal hes cell line Variant of hes cell line (morphological differences) Neural Differentiation Amplification 0.8Mb Page 10

11 次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け幹細胞ゲノミクスの例マイクロアレイ次世代シーケンサ新型の幹細胞を樹立従来の幹細胞と比較幹細胞の自己再生と分化に関わる ncrna を探索転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価培養細胞のゲノムの安定性を調べる ( ゲノム品質管理 ) 既知の mrna 発現量の全体像を比較既知の ncrna (mirna/lincrna) の発現量変化を分化の段階に応じて多点で解析既知遺伝子のプロモータ領域で ChIP-on-chip CGH アレイで reference DNA と比較 ( 特殊な用途 ; 未知の mrna/ncrna の発現量の違いを比較 ) ( 特殊な用途 ; 未知の ncrna の発現量の違いを比較 ) ゲノム全体に対して ChIP-seq ( 非常に特殊な用途 ; リファレンス DNA の配列決定 ) Page 11

12 マイクロアレイ次世代シーケンサーどのように使い分けるか? Microarray Steady state or slow decline? マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度 ( 感度再現性正確性 ) 分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵 Page 12

13 マイクロアレイアプリケーションの広がりゲノムのコピー数変化クロマチンによる発現制御転写因子やポリメラーゼとの関連 mrna 遺伝子発現の変化配列情報の変化の影響エピゲノム ' メチル化 ( による制御 ncrna や Splicing による制御 Page 13

14 なぜ高感度 5 log のシグナルレンジが重要なのか? シグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動するケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子 Auxin 関連遺伝子低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある Ogawa, et al., The Journal of urology Hoshi, et al., PNAS 次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは 5 log 全遺伝子の発現を捉えるには 5log は必須 Ali, et al., Nature Method Page 14

15 次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとは? アジレント次世代高感度 DNA マイクロアレイ 1. 感度と測定精度がシーケンサと同等である >5 logのダイナミックレンジ RT-PCRとの高い相関 2. 容易なカスタムアレイ作成のためのフレキシビリティアジレントDNAマイクロアレイ基盤テクノロジーインクジェットによる in situ オリゴ合成際立って高いオリゴ合成収率特異性とTmを考慮したプローブ設計 3. マイクロアレイの新規活用法 - オリゴライブラリ合成 (SureSelect)

5% cycle yield, no depurination 98% cycle yield, with depurination 99.

16 Fraction Full Length (%) アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ '60mer( が搭載されている Nucleic Acids Res. (2010) % cycle yield, no depurination 99.5% cycle yield, no depurination 98% cycle yield, with depurination 99.5% cycle yield, with depurination 80 高精度インクジェットプリンティングにより長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成高い合成収率 '99.5% 以上 ( 高感度高品質高精度スポット抜けがない高いフレキシビリティ低シグナルのデータまで正確に検出 Agilent Competition Oligo Length (mer)

17 アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化 G1 44K G2 244K G3 1M 1.9K 44K 105K 400K 180K Scanner C version 15K 60K 超長鎖オリゴの新規活用法 DNA RNA オリゴライブラリ CGH CNV Cyto ChIP-on-chip Methylation Gene Expression Alternative Splicing Emerging Applications (SureSelect) Page 17

プローブ設計の流れヒトマウスラット cdna ライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能 ' 設計料は無償 ( 1. 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインし Gene Bin を決定 Refseq Ensembl GenBank mrna UniGene RIKEN(mouse) 2.

18 プローブ設計の流れヒトマウスラット cdna ライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能 ' 設計料は無償 ( 1. 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインし Gene Bin を決定 Refseq Ensembl GenBank mrna UniGene RIKEN(mouse) 2. 各 Gene Bin のコンセンサス配列を決定 3. コンセンサス配列ごとに 3 個の候補プローブを作成 4. プローブの検証実験 5. 最適なプローブを選択 Gene Bin A D B C 3 Genome sequence Transcript Sequences Consensus Sequences Candidate Probes Page 18

19 生物種フォーマット生物種フォーマットイヌ Canine 4x44K イネ O. Sativa 4x44K イヌ (V2) Canine 4x44K 大麦 Barley 4x44K ウシ Bovine 4x44K 小麦 Wheat 4x44K 哺乳類鳥類サル Rhesus Monkey 4x44K ブタ (V2) Porcine 4x44K ウサギ O. cuniculus 4x44K イヌ (V2) C. familiaris 4x44K 植物シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K タバコ N. tabacum 4x44K ダイズ Soybean 4x44K ウマ E. caballus 4x44K トウモロコシ Maize 4x44K ヒツジ O. aries 8x15K トマト Tomato 4x44K その他チキン Gallus gallus 4x44K イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K 酵母 S.cerevisiae 8x15K 酵母 S.cerevisiae 4x44K 線虫 (V1) C. Elegans 4x44K 線虫 (V2) C. Elegans 4x44K 大腸菌 E. Coli 8x15K 両生類魚類セイヨウアブラナワタタルウマゴヤシアフリカツメガエル Brassica napus Gossypium hirsutum Medicago truncatula Xenopus Laevis 4x44K 4x44K 4x44K 4x44K ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K タイヨウサケ S. Salar 4x44K Page 19 ハマダラ蚊 A. gambiae 4x44K ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K cdnaライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能 ' 設計料は無償 (

20 カスタムマイクロアレイデザイン料無償 1 枚から作れる画期的なカスタムアレイ earray ログインプローブ選択フォーマットの選択アレイの注文ユーザー登録無料 ( ご利用約款への同意が必要です ) Probe database -Gene Expression -CGH -ChIP-on-chip -mirna Probe Design ( 遺伝子発現のみ ) アジレントが設計したプローブを無料で利用可能 244K 1M 105K 105 K 400K 400K 44K44K44K44K 180K180K180K180K 15K 15K 15K 15K 15K 15K 15K 15K 60K 60K 60K 60K 60K 60K 60K 60K 1 枚からオーダー可能ご利用可能アプリケーション :Gene Expression, CGH, ChIP-on-chip, mirna

21 遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイル 'FASTA 形式のトランスクリプト配列リストまたは GenBank の AccessionID リスト ( を 1 つ用意しますターゲット配列のインプット ( 配列あるいは GeneBank ID) earray が行うステッププローブの報告設計可 / 不可の判断配列のクラスタリングマスキングプローブの設計相同性のチェック

22 遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズムインプットされたターゲット配列設計可不可の判断プローブの設計ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがありますクラスター 1 クラスター 2 完全一致の配列は片方からしか設計されませんクラスター 3 その他 ' クラスター分けなし ( ターゲット配列のクラスタリング 95% 以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられますクラスター 1 クラスター 2 相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません ' 同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません ( クラスター 1 クラスター 2 クラスター 3 その他 ' クラスター分けなし ( クラスター 3 その他 ' クラスター分けなし ( Page 22

各遺伝子プロファイリング手法の特徴他社従来の発現マイクロアレイ新アジレント発現マイクロアレイ次世代シーケンサデジタル遺伝子発現遺伝子の網羅性中 ~ 高高高新規の遺伝子事前に配列情報が必要前情報必要なしデータ量 KB MB TB スタート Total RNA 量 50 ng ~ 10 ng ~ ( 真核生物 ) 2010 年 1 μg ~ 実験時間 2~3 日 1.

23 各遺伝子プロファイリング手法の特徴他社従来の発現マイクロアレイ新アジレント発現マイクロアレイ次世代シーケンサデジタル遺伝子発現遺伝子の網羅性中 ~ 高高高新規の遺伝子事前に配列情報が必要前情報必要なしデータ量 KB MB TB スタート Total RNA 量 50 ng ~ 10 ng ~ ( 真核生物 ) 2010 年 1 μg ~ 実験時間 2~3 日 1.5 日 1 週間以上操作の簡便性やや煩雑簡便煩雑感度低高高ダイナミックレンジ 3 log 10 5 log 10 5 log 10 コスト約 3.5 万円 / サンプル約 100 万円 / サンプル ( 必要な読取り深度による *) 新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能 Page 23

24 アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出 MCF7 の遺伝子発現レベルと関連する GeneOntology カテゴリー TOP5 5 ケタ超にわたるダイナミックレンジ低発現領域をノイズと区別して検出代謝や生合成関連転写制御関連シグナル伝達関連 Page 24

25 他社アレイデータとの比較 Agilent vs. Company N Agilent 4x44K MAQC A Sample Agilent 8x60K MAQC A Sample Company N 12x135K MAQC A Sample R = ng R = ng R = µg アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ない total RNA 量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能 Agilent data: Log 2 75 th percentile-normalized signals Nimblegen data: Log 2 quantile normalized signals Page 25

26 3 種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット Liu, Y., et al., Nucleic Acids Res. (2010) 1. 遺伝子発現マイクロアレイ mrnaの発現解析 4x44K mrna+lincrnaの発現解析 8x60K lincrna はヒトおよびマウスに対応 2010 年 Myoblast ( 筋芽細胞 ) T0 T24 Myotube ( 筋管細胞 ) 2. mirna マイクロアレイ 8x15K, 8x60K mirna の発現解析スプライシングバリアントの検出 Coming soon 3. Exon マイクロアレイ 2x400K, 4x180K New! スプライシングバリアントの検出 Page 26

遺伝子発現マイクロアレイ (8x60K) ヒトマウスラット製品ラインナップ 2010 60K - より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計 (Whole Genome 遺伝子発現アレイ 4x44k v2 のプローブをすべて含みます ) - 最少 10ng の total RNA からスタート可能 ( 推奨 25ng 以上 ) - 今話題の lincrna を搭載 (Human

27 遺伝子発現マイクロアレイ (8x60K) ヒトマウスラット製品ラインナップ K - より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計 (Whole Genome 遺伝子発現アレイ 4x44k v2 のプローブをすべて含みます ) - 最少 10ng の total RNA からスタート可能 ( 推奨 25ng 以上 ) - 今話題の lincrna を搭載 (Human および Mouse)! 型番製品名参照データベースデザイン内容 G4851A SurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 860K Refseq Build 36.3 Ensembl Release 52 Unigene Build 216 (April 2009) mrna from UCSC (April 2009) Entrezgene targets:27,958 lincrna:7,419 snorna, rrna, miscrna, snrna, pseudo 対応プローブ搭載 G4852A SurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 860K Refseq Build 37 Ensembl Release 55 Unigene Build 176 (April 2009) mrna from UCSC (April 2009) Entrezgene targets:34,017 lincrna:4,623 snorna, scrna, rrna, miscrna, snrna, pseudo 対応プローブ搭載 G4853A SurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 860K Refseq Build 36.2 Ensembl Release 55 Unigene Build 177 (October 2008) mrna from UCSC (January 2009) Entrez gene targets:26,930 miscrna, pseudo 対応プローブ搭載 Page 27

28 The Alternative strategy to discover lincrnas Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence Developed a method, called Scripture, began with gapped alignments of reads across splice junctions There has been important recent progress, including efficient gapped aligners (for example, TopHat) that can map short reads that span splice junctions. A posteriori approach, i.e. K4-K36 domain required stringent criteria, e.g. well separation from the nearest gene locus. Page 28

8x60K フォーマット発現アレイの特別コンテンツ lincrna を追加 ( ヒト / マウス ) large intervening non-coding RNA 200 nt 以上多くは 1 kb ~ 10 kb 遺伝子間に存在 mrna と同様に -RNA polymerase II により転写される -5 キャッピング

29 8x60K フォーマット発現アレイの特別コンテンツ lincrna を追加 ( ヒト / マウス ) large intervening non-coding RNA 200 nt 以上多くは 1 kb ~ 10 kb 遺伝子間に存在 mrna と同様に -RNA polymerase II により転写される -5 キャッピングポリA 付加される Low Input Quick Amp kit 使用可能 mrnaと同時検出! 哺乳類によく保存されている機能の保持 volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology GuttmanM et.al., Nature, 458, (2009) Page 29

30 Log 2 mes Replicate #3 Log 2 mes Replicate #3 Five Logs Linear Dynamic Range lincrna も 5log にわたって検出 2 アレイで検出されたプローブ緑 :lincrna 対応のプローブ G3 Mouse 8x60K All Biological Probes r = n = 34,599 lincrna Probes Only r = n = 8,947 Log 2 mes Replicate #1 サンプル : マウス ES 細胞 Log 2 mes Replicate #1 lincrna も 5log にわたり高い再現性で検出 Page 30

31 Log 2 Microarray Signals 組織特異的に発現する lincrna 6 種のマウス cell line を使用 2 つの lincrna が脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す lincrna-1 lincrna-2 Brain-Specific mrna G3 Mouse 8x60K 8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 11.0 lincrna-1 Brain-Specific mrna lincrna-2 * Unpublished data courtesy of Guttman et al Page 31 qpcr Data lincrna-1 lincrna-2

32 エピジェネティックな発現制御に関わる lincrna HOTAIR HOX Cのアンチセンスにコード PRC2と相互作用し乳がんの転移に関与 HOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる GuttmanM et.al., Nature, 464, (2010) lincrna-ror(lincrna-st8sla3) P53 を介し ips の再プログラム化に関与 OCT4/NANOG/SOX2 によって転写制御 Nature genetics 42, (2010) Page 32

mirna マイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ Human Mouse Rat mirbaseのバージョン mirbase mature mirna 数マイクロアレイ mirbase mature mirna 数マイクロアレイ mirbase mature mirna 数

15.0 (029152) 815K Rel.14.0 (029298) 815K Rel.12.0 (21828) 815K Rel.10.1 (019119) 680 387 388 350 351 Coming Soon 815K Rel.15.0 (029200) 815K Rel.

33 mirna マイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ Human Mouse Rat mirbaseのバージョン mirbase mature mirna 数マイクロアレイ mirbase mature mirna 数マイクロアレイ mirbase mature mirna 数マイクロアレイ Coming Soon '860K 予定 ( 815K Rel.14.0 (029297) 815K Rel.12.0 (021827) 815K Rel.10.1 (019118) Coming Soon 815K Rel.15.0 (029152) 815K Rel.14.0 (029298) 815K Rel.12.0 (21828) 815K Rel.10.1 (019119) Coming Soon 815K Rel.15.0 (029200) 815K Rel.10.1 (019159) 815K Rel.9.1 (016436) mirbase に登録のあるヒトマウスラット以外の生物も earray でカスタムアレイ作成可能! Page 33

34 アジレント mirna アレイ独自のプローブデザイン mature な mirna を選択的に検出独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインにより mature な mirna を選択的に検出 Page 34

35 体液 ( 血清 / 血漿 etc. ) 中の mirna プロファイリング例マーカーとしての mirna の可能性 PLoS One. 2009;4(5):e5532. Epub 2009 May 14. Down-regulation of mir-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patients. Tanaka M, Oikawa K, Takanashi M, Kudo M, Ohyashiki J, Ohyashiki K, Kuroda M. Department of Pathology, Tokyo Medical University, Tokyo, Japan. 血漿 Proc Natl Acad Sci U S A Mar 17;106(11): Epub 2009 Feb 25. Circulating micrornas, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Wang K, Zhang S, Marzolf B, Troisch P, Brightman A, Hu Z, Hood LE, Galas DJ. Institute for Systems Biology, 1441 North 34th Street, Seattle, WA 98103, USA. 血清 Urol Oncol Apr 16. [Epub ahead of print] A robust methodology to study urine microrna as tumor marker: microrna-126 and microrna-182 are related to urinary bladder cancer. Hanke M, Hoefig K, Merz H, Feller AC, Kausch I, Jocham D, Warnecke JM, Sczakiel G. Kompetenzzentrum für Drug Design und Target Monitoring, Lübeck, Germany; Institut für Molekulare Medizin, UK S-H and Universität zu Lübeck, Lübeck, Germany. Silence Mar 1;1(1):7. microrna as a new immune-regulatory agent in breast milk. Kosaka N, Izumi H, Sekine K, Ochiya T. Section for Studies on Metastasis, National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan. 尿母乳 Page 35

36 アジレント Exon array 新登場! ヒトマウスラット製品ラインナップ Very NEW! 4x180K およびより網羅性の高い 2x400K フォーマット Human, Mouse および Rat 対応各 Exon あたり 1 プローブを設計 400K 180K 遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載ランダムプライマーおよびオリゴ dt プライマーを用いて逆転写プローブ設計時の参照データベース Human Mouse Rat Refseq Build 36.3 Ensembl Release 52 Unigene Build 216 (April 2009) mrna from UCSC (April 2009) Refseq Build 37 Ensembl Release 55 Unigene Build 176 (April 2009) mrna from UCSC (April 2009) Refseq Build 36.2 Ensembl Release 55 Unigene Build 177 (October 2008) mrna from UCSC (January 2009) Page 36

37 Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ Species Array Format Genes Targeted Exons Probes Probes from 8x60K Databases Used for Design 4x180K 20, ,458 19,128 (56%) Refseq Build 36.3, RSNM only* Human 2x400K 27, ,164 26,873 (78%) Refseq Build 36.3 Ensembl Release 52 Unigene Build 216 (Apr 2009) GenBank mrna (Apr 2009) Mouse 4x180K 23, ,984 19,203 (49%) Refseq Build 37, RSNM only* 2x400K 33, ,714 31,608 (80%) Refseq Build 37 Ensembl Release 55 Unigene Build 176 (Apr 2009) GenBank mrna (Apr 2009) RIKEN 3 4x180K 20, ,141 23,444 (50%) Refseq Build 36.2, RSNM only* Rat 2x400K 26, ,270 31,948 (72%) Refseq Build 36.2 Ensembl Release 55 Unigene Build 177 (Oct 2008) GenBank mrna (Jan 2009) *RSNM:Refseq で Accsession ID が NM で始まる遺伝子 2x400K は 4x180K に比べより多くの遺伝子エクソンをカバー Page 37

38 アジレント Exon アレイ実験フロー Total RNA 抽出ラベル化ハイブリダイゼーションアレイ洗浄約 6 時間 17 時間 /65 約 5 分スキャン & 数値化 1 枚 15 分全自動 NanoDrop で濃度純度測定バイオアナライザで RNA 品質 'RIN( をチェック LIQA WT kit 1 回の増幅でラベル化 crna を調製 totalrna 最低必要量 : 25ng' 推奨 50ng 以上 ( Agilent ハイブリダイゼーションキットハイブリチャンバガスケットスライド初めてでも失敗なく確実にハイブリダイゼーション Agilent GE/miRNA Wash buffer set 洗浄液の調製必要なし 8 枚のスライドグラスを同時に洗浄可能 Agilent スキャナ Feature Extraction 全自動スキャン全自動数値化 QC レポートを自動作成真核生物用 1 色法および 2 色法に対応しています Page 38

39 Low Input Quick Amp WT labeling kit 微量スタートが好評な LIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit) が Exon アレイにも対応 Very NEW! トランスクリプト全体を逆転写できるよう WT プライマーを使用遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能 1 色法および 2 色法に対応最少 25ng の total RNA からラベル化可能マイクロアレイフォーマット 8x60K, 8x15K, 4x180K, 4x44K, 2x105K, 2x400K 1x244K, 1x1M 最低必要 total RNA 量 25ng( 推奨 50ng 以上 ) 100ng Page 39

p-value 遺伝子レベルの発現差解析統計処理 Fold change バリアントが検出された領域

40 アジレント Exon アレイデータ解析 GeneSpring GX 11.5 Exon レベルでのフィルター活用 Splicing index Exon レベルでの t-test p-value 遺伝子レベルの発現差解析統計処理 Fold change バリアントが検出された領域 corrected p-values Splicing Index マイクロアレイデータのプロットエクソン上に配置されたプローブ既知のトランスクリプト Page 40

41 発現差? スプライスバリアント? P-value Splice index Intensity ProbeID Evidence 検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある ' 遺伝子発現アレイは 3 端側の身にプローブが搭載されている ) Page 41

42 3 側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくるスプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット 2 サンプル間で発現差がない遺伝子遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある Page 42

Exon, 2x400K, 50 ng Log Ratio A/B Exon, 2x400K, 50 ng Log Ratio A/B SurePrint G3 Exon マイクロアレイ R = 0.949 M = 0.

43 Exon, 2x400K, 50 ng Log Ratio A/B Exon, 2x400K, 50 ng Log Ratio A/B SurePrint G3 Exon マイクロアレイ R = M = N = 654 R = M = N = 83,647 TaqMan Log Ratio A/B RNA-Seq, 1 mg Log Ratio A/B qrt-pcr や RNA-Seq とも高い相関をもつ Page 43

44 次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ遺伝子発現転写因子とゲノムの結合ゲノムの安定性微細構造変化次世代シーケンサ新規転写産物探索 (e.g. non-coding / fusion gene) 限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping 代表ゲノムエピ配列特定領域の変異探索高感度アジレントマイクロアレイ既知の mrna に加え non-coding のプロファイリング簡便で精度よく splicing を検出数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング (e.g. プロモータ領域 / CGIs) 数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価 ( ゲノム品質管理分子 karyotype; acgh) 新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能 Microarrays are still stable, practical, and feasible, which is very useful for most biological researchers. Page 44

Agilent Microarray Total Solution 5 5 RNA-Seq 60 mer DNA in situ DNA 5 2 QC 4200 TapeStation 2100 / mirna CGHCGH+SNP ChIP-on-chip 2 mirna QC

Microarray Agilent Microarray Total Solution Agilent Microarray Total Solution 5 5 RNA-Seq 60 mer DNA in situ DNA 5 2 QC 4200 TapeStation 2100 / mirna CGHCGH+SNP ChIP-on-chip 2 mirna QC RNA / mirna total