NGS ターゲットエンリッチメントシステム 次世代シーケンシング効率化の世界標準 2009 年に発売された SureSelect Target Enrichment システムは 次世代シーケンシングを画期的に効率化し 世界各国の次世代シーケン サユーザーから絶大な支持を集めています すでに Natu

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1 SureSelect / HaloPlex See Deeper. Reach Further.

2 NGS ターゲットエンリッチメントシステム 次世代シーケンシング効率化の世界標準 2009 年に発売された SureSelect Target Enrichment システムは 次世代シーケンシングを画期的に効率化し 世界各国の次世代シーケン サユーザーから絶大な支持を集めています すでに Nature Science をはじめとする主要な雑誌に 400 報近い応用例が報告されており 原因不明のメンデル遺伝病の原因遺伝子の同定において数多くの成果が報告されているばかりではなく がんや糖尿病 神経疾患や 精神疾患など より複雑で一般的な疾患に対しても幅広く応用されています さらに 2012 年 ヒトゲノムを対象にした HaloPlex Target Enrichment システムが登場し より少ない DNA を用いて より簡単に実験を行 うことが可能になりました SureSelect を用いた Exome 解析のフォローアップや 疾患感受性遺伝子パネルによる多検体の解析に活用 されており デスクトップ型次世代シーケンサとの組み合わせで迅速に結果が得られるという利点があります アジレント テクノロジーでは 進化し続けるシーケンサ技術と それに伴い次々と生み出される新たなご要望にこたえるべく 製品の 種類 対応シーケンサ カスタムキット 自動化システム 解析ツールなど次世代シーケンサ用ソリューションを常に拡充 充実させ ています SureSelect の特長 高品質 120 mer のロングオリゴ プローブ 20 bp 程度の Deletion があっても理想的なアレルバ 120 mer の DNA オリゴを アレイ上に製造 ビオチン化 RNA に転写 プローブの作製 ランスでキャプチャ SNP や InDel の影響を受けにく く 高効率で変異を検出 ビオチン化 RNA をプローブとして利用 DNA-DNA より高い DNA-RNA のハイブリ効率プロー ブのコンタミネーションがない 容易なハイスループット化 バイオアナライザ /TapeStation と 定 量 PCR による QC ステップを取り入れた堅牢なプロ トコル HaloPlex の特長 DNA オリゴを切り離す カスタムデザイン作成 わずか 225 ng の gdna からスタート可能 FFPE サンプルにも対応 Web 上の SureDesign で簡単にカスタムライ 専用解析ソフトウェア SureCall でデータ解析 可能 FASTQ ファイルを入力すればアライメントから変異 解析までを自動で実施 コマンドライン不要のシンプルなソフトウェア 2 ビオチン化 DNA プローブを作製 シンプルなプロトコル 短い hands-on time ゲノム DNA の物理的断片化は不要 特別な機器を 必 要 とし な い シ ン プ ル な プ ロトコ ル 2-3 時 間 の hands-on time で 1 日から 1.5 日で完了 ブラリを設計 数万から数十万種類の 120 mer ビオチン化 RNA プローブが 1 本のチューブに入った キットとして出荷 DNA オリゴをアレイ上に製造 最大 200,000 プローブが 1 本のチューブに入った キットとして出荷

3 SureSelect NGS DNA SureSelect XT DNA P.4 P.10 SureSelect XT DNA Methyl-Seq P.8 SureSelect XT HiSeq HSQMiSeq MSQ 5500 SOLiD SureSelect QXT HiSeq HSQMiSeq MSQ SureSelect Methyl-Seq HiSeq HSQ SureSelect IonProton RNA PolyA RNA SureSelect SureSelect Strand Specific RNA Library P.9 Transcript 1. SureSelect XT RNA P.9 P SureSelect XT SureSelect Strand Specific RNA Library

4 SureSelect XT XT2 SureSelect XT DNA XT Human All Exon V5 Human All Exon V5+UTRs Human All Exon V5 +lncrna Human All Exon V5 +Regulatory Human All Exon V5 + DNA Mouse All Exon Bovine All Exon Canine All Exon Zebrafish All Exon Human Kinome DNA Human Chr-X exon 50 Mb Coding V5 UTR V5 8,263 lincrna HGNC 979 non-coding RNA 9.3 Mb V5 V kb DNA DNA 1001 UCSCS mm9 Reference Ensemble RefSeq University of Maryland build 3.1 USDA Coding Exon, Predicted Exon mirna CanFam2 UCSC Tracks RefSeq, Human Protein Alignment Spliced ESTs Ensemble Zv9 library Sanger 612 UTR X X XT Exome Panel DNA DNA Human All Exon V5 50 Mb Human All Exon V5 + UTRs 75 Mb Human All Exon V5 + lncrna 59.3 Mb Human All Exon V5 + Regulatory Mb Human All Exon V5 + DNA 50 Mb EA EA Mouse All Exon 49.6 Mb Bovine All Exon 54 Mb Canine All Exon 54 Mb EA EA Zebrafish All Exon 75 Mb Human DNA Kinome 3.2 Mb Human Chromosome-X 3.1 Mb NGS / HiSeq G9611A G9611B MiSeq G9612A G9612B 5500 SOLiD G9615A G9615B IonProton G9605A G9605B 4

5 XT 120 mer RNA SNP, Indel SureSelect Human All Exon V5 5+UTRs Read V4 SureSelect 120 mer RNA DNA RNA Human All Exon 50 Mb 5 Gb seq Human All Exon V4 51 Mb 4 Gb seq Human All Exon V5 50 Mb 4 Gb seq gdna 20 bp Deletion PNAS BRCA SNP InDel SureSelect 100% 90% 80% SureSelect V54 Gb SureSelect V5+UTRs6 Gb 5 Gb 70% 60% 50% Reference: Detection of inherited mutations for breast and ovarian cancer using genomic capture and massively parallel sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A Jul 13;10728: % 30% % Reads On-target +/ 100 bp % bases > 1x cov. % bases > 20x cov. Allele 1 Allele 2 20bp deletion Deletion Allelic Balance post-capture XT, QXT Human All Exon V5 Human All Exon V5+UTRs 21,522 21, , ,555 CCDS 37.3rel rel 9 RefSeq Rel5101/12 Rel5101/12 GENCODE V10Ensemble 65 V10Ensemble 65 mirbase V18 V18 TCGA V6 V6 UCSC hg19 hg19 VEGA V46 V46 Total 50 Mb 75 Mb Webcast WEB 5

6 SureSelect SureSelect QXT DNA SureSelect QXT Reagent QXT QXT SureSelect QXT DNA 50 ng SureSelect DNA 90 DNA SureSelect QXT 45 AMPureXP PCR PCR AMPureXP QC TapeStation 10 min 11 min 25 min 10 min 16 min 90 min 20 min SureSelect QXT Reagent : 1.5 SureSelect QXT SureSelect XT SureSelect QXT SureSelect QXT 50 ng DNA Library Prep Enrichment Sequence Competitor B Competitor A NGS QXT Work Days SureSelect XT FFPE XT QXT NGS / SureSelect QXT SureSelect QXT Reagent 16 G9682A 96 G9682B 16 G9681A 96 G9681B 6

7 SureSelect QC DNA Total RNA NGS NGS TapeStation QC gdna total RNA QC gdna QC genomic DNA TapeStation genomic DNA gdna Total RNA QC RIN/RINe TapeStation RNA Total RNA RIN/RIN e RNA QC QC DNA SureSelect DNA SureSelect TapeStation PCR QC SureSelect DNA gdna mrna DNA1000 assay TapeStation D1000 assay SureSelect XT NGS DNA DNA RNA DNA1000 assay TapeStation D1000 assay 24 TapeStation Mx3000P/3005P PCR QPCR NGS DNA DNA DNA DNA assay TapeStation HS D1000 assay 7

8 SureSelect SureSelect XT Human / Mouse Methyl-Seq XT DNA SureSelect XT Methyl-Seq 84 Mb 109 Mb PCR CpG CpG Shore Shelves DMRsDifferential Methylated Regions 1 bp NGS Human Methyl-Seq 84 Mb CpG DMRs GENCODe CpG shores and shelves 4 kb DNasel RefGenes Ensemble Regulatory Features Mouse Methyl-SeqEA 109 Mb CpG DMR Ensenmbl Regulatory Features CpG shores and shelves 4 kb DNase I Hypersensitive sites Histone Modifications TFBS Polymerase Open Regulatory Annotatione PromotersORegAnno Enhancers TFBS Regulatory Polymorphisms DNA PBATPost Bisulfite Adapter Tagging Methyl-Seq XT Methyl Human Methyl-Seq 84 Mb Mouse Methyl-Seq 109 Mb EA EA NGS / XT Methyl Reagents HiSeq G9651A G9651B HiSeq 8

9 SureSelect RNA Sequencing RNA SureSelect Strand Specific RNA 50 ng total RNA 99% Duplication Read 5'/3' RNA-Seq RNA-Seq 99% Base SureSelect RNA SureSelect Deep Sequencing SureSelect Strand Specific RNA Library G9691A G9691B * Top 1000 Expressed Transcripts. 50 ng of Human UHRR samples Data normalized to 20 million reads. 2x100 bp sequencing RNA-seq Sequencer SureSelect RNA-Seq Read Depth SureSelect RNA RNA Read Depth gdna SNP InDel Fusion Gene Panel Human Kinome 3.2 Mb NGS / RNA HiSeq G9692A G9692B RNA SOLiD4 G9604A G9604B SureSelect RNA Human Kinome DNA Capture Human Kinome 612 Kinase DNA RNA gdna 9

10 SureSelect SureSelect XT XT XT SureSelect XT DNA 24 Mb XT Custom DNA Re-Order Re-Order Kb Mb Mb ELIDs Mb ELIDs Mb NGS / HiSeq G9611A G9611B MiSeq G9612A G9612B 5500 SOLiD G9615A G9615B Re-Order 2 SureSelect RNA Custom RNA Re-Order Re-Order Kb Mb Mb NGS/ HiSeq G9601A G9601B Re-Order 2 10

11 SureSelect 1 Web earray SureDesign SureSelect DNA SureDesign SureSelect RNA earray SureSelect SureDesign HaloPlex SureSelect DNA SureDesign SureDesign 16 DNA ID SNP ID UTR Enrich DNA Target interval 24 Mb Bait SureDesign Human All Exon V5 1 Exome Plus Bait Group1 Library Bait Group2 SureDesign DNA SureDesign UCSC Masking x2 x5 SureSelect RNA earray RNA earray 79 Transcriptome GenBank ID Transcript UniGene earray Transcriptome 1 SureSelect XT Custom 1 Kb Kb 57,680 1 Kb Kb 150 SureSelect XT Custom Mb 57, Mb 900 SureSelect XT Custom Mb 57, Mb 1,300 SureSelect XT Custom Mb 115, Mb 2,500 SureSelect XT Custom Mb 173, Mb 5,000 11

12 HaloPlex HaloPlex PCR 1 200, coding exon Exome 5 Mb 225 ng DNA HaloPlex 225 ng gdna FFPE 2-3 hands-on time1 1.5 SureDesign HiSeqMiSeq Ion Torrent gdna 225 ng Hands-on time ,000 5 Mb2.5 MbIon PGM HaloPlex 1 PCR HaloPlex 5 Mb Ion PGM 2.5 Mb Specificity% basses on-target > 99% * Uniformitycoverage at 10% of mean > 90% * * kb 12 HiSeqMiSeqIon PGM 12

13 HaloPlex HaloPlex Step 1. gdna 8 DNA 8 double-digestion bp in silico HaloPlex 20bp 20bp Step 2. HaloPlex I n d e x i n g P r i m e r Cassette gdna HaloPlex HaloPlex 200,000 HaloPlex gdna Step 3. DNA/HaloPlex Probe DNA Step 4. PCR DNA Indexing Primer Cassette 1 DNA HaloPlex 1 DNA PCR 200,000 1 PCR AMPure 4 Step 5. HaloPlex SureCall 13

14 t HaloPlex ターゲットエンリッチメントシステム カスタムデザインキット デザインの過程でターゲット領域のカバー率が判明 両鎖キャプチャや FFPE オプションなど多彩な機能 シンプルで直観的に操作できる SureDesign により 簡単にカスタムデザインの作成が可能です 選択され たアンプリコンの位置から ターゲット配列のカバー率が自動的に計算されます 両鎖キャプチャのオプション FFPE 処理による片側 Strand の Artifact を除去 FFPE 対応オプション 断片化の進んだ FFPE サンプルのカバー率を向上させるため より短いサイズの アンプリコンが自動的に選択されます イルミナシーケンサで 1 kb-5 Mb IonPGM で 1 kb-2.5 Mb の領域で自由な設計が可能です カタログキット 設計済みの Panel で手軽に変異解析 HaloPlex Cancer リサーチパネル がん関連 46 遺伝子の合計 526 ホットスポットを網羅的 に解析 FFPE サンプルに対応したデザイン Research Use Only HaloPlex 心筋症リサーチパネル 肥大型心筋症 拡張型心筋症 不整脈原性右室心筋症 関連の 34 遺伝子を含むデザイン Uppsala 大学 Dr. Berivan Baskin との共同開発 Research Use Only その他の設計済み疾患リサーチパネルについては お問い 合わせください HaloPlex Cancer リサーチパネル遺伝子リスト ABL1 CDKN2A FANCA FGFR3 JAK3 NOTCH1 PTEN STK11 AKT1 CSF1R FANCC FLT3 KIT NPM1 RET TP53 ALK CTNNB1 FANCF HRAS KRAS NRAS RUNX1 VHL AR EGFR FANCG IDH1 MAP2K1 PDGFRA SMAD4 WT1 MAP2K4 PIK3CA ATM ERBB2 FGFR1 IDH2 BRAF ERBB4 FGFR2 JAK2 MET SMO PIK3R1 SRC HaloPlex 心筋症リサーチパネル遺伝子リスト TTR MYH6 TNNI3 MYL2 MYH7 MYL3 MYBPC3 MYOZ2 TNNT2 NEXN ACTC1 CSRP3 DES TPM1 PLN TTN TNNC1 ACTN2 TCAP DSG2 LDB3 RBM20 LMNA ABCC9 TGFB3 DSC2 SGCD SCN5A DSP TMEM43 VCL TAZ PKP2 JUP 製品一覧 HaloPlex Target Enrichment Panel 製品名 反応数 HaloPlex Cancer リサーチパネル HaloPlex 心筋症リサーチパネル イルミナ対応 G9903A G9903B G9908A G9908B IonPGM 対応 G9904A G9904B G9909A G9909B 96 反応キットは NGS 自動化システムに対応 製品一覧 HaloPlex Target Enrichment カスタムキット 製品名 ターゲットサイズ kb プローブ数 <20 K HaloPlex Target Enrichment イルミナ対応 501 kb Mb 20 K=< プローブ数 <200 K Mb 20 K=< プローブ数 <200 K HaloPlex Target Enrichment Ion PGM 対応 kb プローブ数 <20 K 251 kb Mb 20 K=< プローブ数 <200 K カスタムキット 全キット NGS 自動化システムに対応 14 反応数 型番 G9901C G9901B G9911C G9911B G9921C G9921B G9902C G9902B G9912C G9912B

15 SureSelect / HaloPlex SureCallSureSelect/HaloPlex Human FASTQ SureCall SureSelect, HaloPlex PC FASTQ SureSelect, HaloPlex PC SureSelectHuman, HaloPlex FASTQ BAM Ion PGM OSWindows 7RAM 12 GB8 GB 500 GB SureCall Mutation Table Genome Viewer SureCall SureCall BWA TMAP Mutation Mutation QC Mutation Mutation Table Mutation Table Genome Viewer 15

16 Bravo NGS 8 96 NGS Agilent Bravo NGS A AMPure SureSelect HaloPlex Agilent Bravo NGS Workstation B SureSelect/HaloPlex NGS Bravo NGS Bravo NGS A HaloPlex AMPure AMPure SureSelect AMPureXP DNA NGS 8-96 Bravo NGS Workstation B Bravo 20 DNA SureSelect 96 8 SureSelect 24, 48, 96 Strand Specific RNA 3 96 NGS TruSeq PCR-Free DNA-SeqRNA-Seq AMPureXP NGS NGS NGS NGS 1 SureSelect XT, HaloPlex, Strand Specific RNA SureSelect QXT TruSeq PCR-Free DNA-Seq TruSeq Nano DNA-Seq TruSeq RNA-Seq TruSeq ChIP NEBNext ChIP-Seq Epicentre Ribo-Zero KAPA HTP Library Prep PacBio 10 kb Template Prep AMPureXP AMPureXP 16

17 Bravo NGS SureSelect NGS PCR /TapeStation QC SureSelect / / PCR PCR / / SureSelect XT Exome Re-Order Human V5 50 Mb Human V5+UTRs 75 Mb Human V5+lncRNA 59.3 Mb Human V5+Regulatory Mb Human V5+mtDNA 50 Mb Panel Human Kinome 3.2 Mb Custom Kb Mb Mb ELIDs Mb DNA NGS / 3ELIDs Mb HiSeq G9641B G9641C MiSeq G9642B G9642C NGS HaloPlex P.13 17

18 QC TapeStation QC TapeStation ScreenTape DNA RNA genomic DNA 25 96Well Plate ScreenTape 96 2 DNA loading buffer DNA D1000 dsdna bp, ng/µl DNA High Sensitivity D1000 dsdna bp, pg/µl Genomic DNA ,000 bp, ng/µl DNA * *2 RNA RNA ng/µl RNA High Sensitivity RNA ,000 pg/µl DNA QC Genomic DNA Kit 1 µl DNA QC DNA RNA DNA-Seq RNA-SeqChIP-Seq QC SureSelect DNA DNA DNA1000 dsdna bp, ng/µl High Sensitivity DNA dsdna bp, pg/µl RNA ng/µl RNA pg/µl 18

19 QC & QPCR NGS Mutant Taq Brilliant III Ultra-Fast NGS DNA Standard Primer 1 SureSelect 84 PCR G4880AQPCRNGS G4881AQPCRNGS AB SOLiD Avadis-NGS GUI GeneSpringAvadis-NGS GeneSpring SAM/BAM ELAND Export FASTA/FASTQ Aligner DNA Variation DNA SNPsINDEL SNP Effect RNA-Seq cdna Splice Variant SNPs ChIP-Seq Small RNA-Seq mirnasnrnasnorna Non-codingRNA Avadis-NGS GO Gene Ontology GSEA/GSA BROAD Institute GeneSet 19

20 / Agilent Technologies, Inc Printed in Japan, Jun. 1, JAJP